Effect of MMR status and growth rate of colon carcinoma cells in response to 5-fluorouracil

Abstract

Mismatch repair (MMR) system plays an important role in the repair of damaged DNA. 10-15% of sporadic colorectal cancers and more than 40% of hereditary- nonpolyposis colorectal cancers (HNPCC) are MMR-deficient, most frequently as a result of a mutation in one of the MMR genes: hMLH1 or, much less frequently, hMSH2 or hMSH6. Whether the MMR deficiency increases or decreases the sensitivity of colon carcinomas to 5-fluorouracil (5FU) is a matter of controversy. Clarification of the effect of MMR status on colon carcinoma susceptibility to 5FU is necessary to establish criteria for selecting the population of patients who will benefit from treatment. Apart from the DNA repair function, MMR has been reported to affect cell proliferation (57-60). Whether MMR increases or decreases cell proliferation is not clarified. The main aim of my work was to investigate the cellular mechanism of 5FU cytotoxicity and how MMR status and growth speed influence it. I investigated the effect of MMR on cell proliferation.The investigation was carried out in isogenic (mock 1-transfectants and clone 43), semiisogenic (HCT116, HCT116+chr2 and HCT116+chr3) colon carcinoma cell linesand tumour xenografts differing in their MMR status.The present data showed that MMR does not affect cell proliferation and demonstrate that the MMR affects clonogenic survival after 5FU treatment. The lesser clonogenic survival in MMR-proficient cells was associated with more DNA-double strand breaks and more short-term apoptosis than MMR-deficient cells. The data showed for the first time that MMR mediated senescence and not apoptosis determines low clonogenic survival in response to 5FU treatment. The data showed that the cell density affects the response to 5FU treatment. I investigated the long-term response of cells grown at a high density which may give more information about the in vivo response than the cells grown at a low density i.e. grown in clonogenic assay. The data showed for the first time that the long-term cell survival in response to 5FU is determined by programmed necrosis which is regulated by the growth speed and not by the MMR. The necrosis was dependent on the presence of caspase protease and of Bax protein. The data in mouse model in vivo showed for the first time that tumour growth speed is a much more important determinant of response to 5-fluouracil than the MMR status. In sum, the present data indicate that MMR does not affect cell proliferation. The growth speed and not MMR determines long-term cell response to 5FU treatment. Cell growth inhibition and not the cell death is the main effect of 5FU cytotoxicity.

Das mismatch Reparatur System (MMR) spielt bei der Reparatur der DNA Schäden eine wichtige Rolle. 10-15% von sporadischen Kolonkarzinomen und alle HNPCC Kolonkarzinome weisen MMR-Defekte auf. Diese entstehen auf Grund einer Mutation in einem der MMR-Gene, wie hMLH1 oder, weit weniger häufig, hMSH2 oder hMSH6. Ob ein MMR-Defekt die Sensitivität des Kolonkarzinoms auf 5-Fluorouracil (5FU) steigert oder vermindert, wird kontrovers diskutiert. Ebenfalls ungeklärt ist der Einfluss von MMR auf die Zellproliferationsrate. Die Klärung des Einflusses des MMR-Status auf die Sensitivität der Zellen auf 5FU würde erlauben die Patienten zu identifizieren, die von der Behandlung profitieren. Das Hauptziel meiner Arbeit war es zu untersuchen, inwieweit MMR und die Zellproliferationsrate die Mechanismen der Zytotoxizität von 5FU beeinflussen. Die Analysen wurden in isogenen und semiisogenen Paaren von Kolonkarzinomzelllinien und in xenotransplantierten Tumoren, die sich hinsichtlich ihres MMR-Status unterschieden, durchgeführt. Die Daten zeigten, dass MMR die Zellproliferationsrate nicht beeinflusst. Die geringere klonogene Überlebensrate der MMR-kompetenten im Gegensatz zu den MMR defizienten Zellen war nicht durch Apoptose sondern durch einen langfristigen Arrest und anschliessende Seneszenz der MMR-kompetenten Zellen verbunden. Die Untersuchung der Langzeitwirkung von 5FU zeigte, dass sie nicht durch den MMR Status sondern hauptsächlich duch die Proliferationsrate der Zellen bestimmt ist. Auf der zellulären Ebene bestimmt die Nekrose das Ausmaß des langfristigen Zelltodes. Die Nekrose in vitro ist von den Caspasen und von dem bisher nur als proapoptotisch charakterisierten Protein Bax abhängig. Die gesamte antiproliferative Wirkung von 5FU wird jedoch nur in geringem Maße von dem nekrotischen Zelltod bestimmt, vielmehr macht die Inhibition der Proliferation den Hauptanteil der Zytotoxizität aus.