Standardanalysepanel zur immunphänotypischen Charakterisierung von klassischen und neuartigen Zelltherapeutika sowie ATMPs mit und ohne Stammzellen

Abstract

In der Entwicklung von zellulären Produkten stieg der Aufwand für die Qualitätskontrollbestimmungen zur Freigabe von Arzneimitteln für neuartige Therapien (Advanced Therapy Medicinal Products, ATMPs). Während die frühere Analytik beispielsweise auf die Stammzellbestimmung der Kolonie-bildenden Einheiten (CFU-Assay) oder die Drei- Farben-Durchflusszytometrie sowie auf die Sterilkontrolle setzte, sind heute bei ATMPs zusätzlich die Bestimmung von Endotoxin und Mykoplasmen notwendig und die Effektivität der Zellen ist mittels eines Potency-Assays nachzuweisen. Die immunphänotypische Analyse der Zielzellen wurde um die Bestimmung weiterer Zellpopulationen erweitert und wird nun im Verlauf der Herstellung vor und nach der Apherese sowie am Endprodukt bestimmt. Des Weiteren sollen die transfundierten Zellen möglichst auch im Empfänger:in nachgewiesen werden. Um die fortlaufende Qualität der zellulären Produkte zu sichern, sind standardisierte Prozesse und daher gezielte Analysen mit breiter Anwendung auf mehrere Zellprodukte in der Routineanwendung erforderlich. Dies reduziert den Aufwand der Methodenvalidierung als behördliche Voraussetzung für eine Herstellungserlaubnis. Im Fokus der Herstellung von Standard-Stammzellprodukten, selektierten Zellprodukten und ATMPs liegen neben den Stammzellen vorrangig die T- und B-Zellen. Im Rahmen meiner Doktorarbeit entwickelte einen immunphänotypischen Assay eines Analysepanel mit getrockneten Bestandteilen wie fluoreszenzbasierten Antikörpern (Ak) (anti- CD45 Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), anti-CD34 Phycoerythrin (PE), anti-CD3 Pacific Blue (PB) und anti-CD19 Allophycocyanin (APC)) inklusive Zählpartikel und Totfarbstoff 7-Aminoactinomycin (7-AAD), um zielorientiert und standardisiert die durchflusszytometrische Detektion von Leukozyten, Stammzellen nach dem International Society of Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE)-Protokoll sowie T- und B-Zellen simultan in einem Röhrchen zu ermöglichen. Parallel wurde das gleiche Paneldesign in flüssiger Form auf Basis eines bereits zugelassenen Kits zur Stammzell-Bestimmung mit demselben Ziel der breiten, standardisierten Anwendung für zelluläre Arzneimittel etabliert. Umfangreiche Validierungsmaßnahmen zeigten eine hohe Linearität, Sensitivität und Richtigkeit der Assays selbst und im Vergleich mit den sowohl getrockneten als auch den flüssigen Fluoreszenz-Ak an diversen Zellprodukten, wie autologen und allogenen Stammzellprodukten, Stammzellen aus Knochenmark sowie extrakorporale Photopherese (Extracorporeal Photopheresis, ECP) -Produkten. Weitere Validierungsmessungen bestätigten die Machbarkeit des Methodentransfers bei Modellwechsel der Durchflusszytometer.

With the development of cellular products, the effort of quality control regulations for the release of advanced therapy medicinal products (ATMP) has increased. While earlier analysis was based, for example, on determining the stem cell count of the colony-forming units (CFU assay) or three-color flow cytometry and sterility control, ATMPs today also require the determination of endotoxin and mycoplasma and the effectiveness of the cells can be demonstrated using a potency assay. The immunophenotypic analysis of the target cells has been expanded to include the determination of additional cell populations and is now carried out in the course of production, before and after apheresis and on the end product. If possible, the transfused cells should also be detected in the recipient during monitoring. In order to ensure the quality of the cell products in the long term, standardized processes and thus targeted analyzes with broad application to several cell products in routine use are required. This reduces the effort involved in validating the method as an official requirement for a manufacturing license. In addition to the stem cells, the focus of the production of standard stem cell products, ATMP starting material and the ATMPs themselves is on the T and B cells. During my thesis I have developed an immunophenotypic assay using a dried antibody panel (anti-CD45 fluorescein isothiocyanate (FITC), anti-CD34 phycoerythrin (PE), anti-CD3 Pacific Blue (PB) and anti-CD19 allophycocyanin (APC)) including particle counting and the death marker 7-aminoactinomycin (7-AAD) for the targeted and standardized flow cytometric detection of leukocytes, stem cells according to the protocol of the International Society of Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE) as well as T and B cells simultaneously in one tube. At the same time, the same panel design was established in liquid form based on an already approved kit for determining stem cells with the same goal of broad, standardized application for cellular products. Extensive validation measures demonstrated a high level of linearity, sensitivity and accuracy of the tests themselves and in comparison, to both the dried and liquid fluorescent antibodies on various cell products such as autologous and allogeneic stem cell products, bone marrow derived stem cells and extracorporeal photopheresis (ECP) products. Further validation measurements confirmed the feasibility of method transfer when changing the flow cytometer model.