Zwei Wege, Nukleotide zu binden: Kristallstrukturen der Nicotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase von Homo sapiens und der Domäne I der Homing Endonuklease PI-SceI von Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) ist ein bedeutendes Molekül als Coenzym bei zellulären Redox-Reaktionen und Signaltransduktionswegen. An seiner Biosynthese ist das Enzym Nicotinamid/Nicotinat-Mononukleotid- Adenylyltransferase (NMNAT/NaMNAT) beteiligt, indem es den Adenosin- Monophosphat-Teil von ATP auf Nicotinamid- oder Nicotinat-Mononukleotid (NMN/NaMN) überträgt. Die Kristallstruktur von NMNAT von Homo sapiens im Komplex mit NMN wurde mit einer maximalen Auflösung von 2.9 Å durch die SAD-Methode gelöst. Die Struktur von NMNAT besteht aus einem sechssträngigen parallelen b-Faltblatt mit Helices auf beiden Seiten, welches im Kern dem Rossmann-Faltungstyp entspricht. Elektronendichte wird weiterhin für den Liganden NMN beobachtet, nicht jedoch für eine Schleife von 37 Aminosäuren, Reste 109 bis 146, die strukturell ungeordnet sind. Von den homologen Proteinen aus M. thermoautotrophicum und M. jannaschii unterscheidet es sich durch diese Schleife, die eine nukleäre Lokalisationssequenz NLS enthält, und durch zusätzliche Aminosäuren, die im humanen Enzym die Helices H und I sowie den Strang f bilden. Diese Sekundärstrukturelemente verursachen ein unterschiedliches Oligomerisierungsverhalten als in den Proteinen aus Archaea, die jedoch alle als biologische Einheit ein Hexamer bilden. Bakterielle NMNAT kommt dagegen als Monomer (E. coli) oder Dimer (B. subtilis) vor und weist im Fall von E. coli NMNAT noch weitere zusätzliche Sekundärstrukturelemente auf. An der Bindung des Liganden NMN sind die Aminosäuren Ser16, Lys57, Trp92, Thr95, Leu168 und Trp169 beteiligt, die sich alle auf einer Seite des b-Faltblattes befinden. Durch einen Vergleich mit weiteren, von anderen Gruppen publizierten Strukturen der humanen NMNAT (dem Apoenzym und dem NAD+-Komplex) sowie mit den Archaea- und Prokaria-Analoga wurde ein Modell für die Ligandenbindung und Synthesereaktion entwickelt.

Die Homing Endunuklease PI-SceI von S. cerevisiae ist ein Intein, eine interne Proteinsequenz, eingebettet in die Extein-Sequenzen der 69 kDa-Untereinheit der vakuolären Membran-H+-ATPase. In einem Protein-Splicing-Prozess schneidet sie sich selbst aus dem Vorläuferprotein heraus. Verantwortlich hierfür ist die Domäne I von PI-SceI, die gleichzeitig den Hauptteil der Bindungsenergie für eine spezifische DNA-Sequenz von mindestens 31 bp liefert. Die Domäne II von PI-SceI besitzt das endonukleolytische Zentrum, welches die spezifische Erkennungssequenz schneidet und die Insertion des vde-Gens initiiert ("homing"). Die Kristallstruktur der Domäne I von PI-SceI wurde mit der Methode des Molekularen Ersatzes bei einer maximalen Auflösung von 1.35 Å gelöst. Der Kernbereich der PI-SceI Domäne I nimmt den Hint-Faltungstyp der Hedgehog /Intein-Domäne ein und besteht hauptsächlich aus b-Strängen. Das aktive Zentrum der Domäne I, die Protein-Splicing-Stelle, zeigt neben Cystein1 noch zwei N-terminale Extein-Reste, ihm fehlt jedoch mit Asn454 der Intein-C-Terminus. Das gängige Modell für den ersten Schritt des Protein- Splicing-Reaktionsmechanismus' kann strukturell bestätigt werden. Die Reste Gln55 bis Glu66 wurden aufgrund lokaler Unordnung nicht in der Elektronendichte beobachtet. Sie bilden offenbar eine flexible Schleife, die im Verdacht steht, an der festen DNA-Bindung der Domäne I beteiligt zu sein. Die weiteren Reste, denen aufgrund biochemischer Daten eine Beteiligung an der Bindung zugerechnet wird, befinden sich alle an der Vorderseite der zangenartigen Subdomäne, die von den Strängen i, j und k sowie von den Helices B und C gebildet wird. Wahrscheinlich können auch die Helices D und E sowie der Strang l dazugezählt werden, wo ebenfalls potenziell DNA bindende Aminosäuren liegen. Für diese Subdomäne wird aufgrund eines geometriebasierten Docking-Modells eine Flip-Bewegung für möglich gehalten, die etwa 60º relativ zum Kernbereich der Domäne I beträgt.

Nicotinamide adenin dinucleotide (NAD+) is an important molecule as coenzyme in cellular redox reactions and signal-transduction pathways. The enzyme nictotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT/NaMNAT) takes part in the biosynthesis of NAD+ by transferring the adenosine monophosphate moiety of ATP to nicotinamide/nicotinate mononucleotide. The crystal structure of NMNAT from Homo sapiens in complex with NMN was solved to a maximum resolution of 2.9 Å with the SAD method. The structure of NMNAT consists of a six-stranded parallel b-sheet with helices on both sides, which in the core is the Rossmann fold. Electron density was observed for the ligand NMN but not for a loop of 37 amino acids, residues 109 to 146, that is positionally disordered. The structure of hNMNAT differs from the homologous proteins of M. thermoautotrophicum and M. jannaschii by this loop that contains a nuclear localization signal and by additional amino acids that form the helices H and I and the strand f in the human enzyme. Those secondary structure elements cause a different oligomerization compared to the archaeal proteins but all occur as hexamer as biological unit. Bacterial NMNATs occur as monomer (E. coli) or dimer (B. subtilis) and in the case of E. coli NMNAT has further secondary structure elements. The ligand NMN is bound by the amino acids Ser16, Lys57, Trp92, Thr95, Leu168 and Trp169, all on one side of the b-sheet. Comparison of the NMN complex with human NMNAT structures solved by other groups (the apoenzyme and the NAD+ complex) and with the archaeal and procarial homologs yield a model for ligand binding and synthesis.

The homing endonuclease PI-SceI of S. cerevisiae is an intein, an internal protein, embedded into the extein sequences of the 69 kDa subunit of the vacuolar membrane H+-ATPase. In a protein splicing process it cuts itself out of the protein precursor. Responsible is domain I of PI-SceI that at the same time accounts for most of the binding energy to the specific DNA sequence of at least 31 bp. Domain II of PI-SceI contains the nucleolytic center, which cuts the specific recognition sequence and initiates the insertion of the vde- gene ("homing"). The crystal structure of domain I of PI-SceI was solved with the molecular replacement method to a maximal resolution of 1.35 Å. The core of PI-SceI domain I adopts the Hint fold of the Hedgehog/intein domain and consists mainly of b-strands. The active center of domain I, the protein splicing site, has cysteine 1 and two N-terminal extein residues but lacks the C-terminus of the intein, Asn454. The common model for the first step of the protein splicing reaction mechanism can be structurally confirmed. Residues Gln55 to Glu66 were not observed in the electron density due to local disorder. They obviously form a flexible loop that is suspected to take part in the tight binding of DNA by domain I. Further residues that are supposed to participate in DNA binding because of biochemical data, lie at the front side of a tongs-like subdomain that is formed by strands i, j and k and helices B and C. Most likely, helices D and E as well as strand l are also part of this subdomain because they also contain potential DNA-binding residues. A geometry based docking model makes the possibility of a movement of about 60º relative to the core visible.