Comprehensive profiling of circulating tumour cells for development of liquid biopsy biomarkers

Abstract

Solid tumours constantly shed tumour cells into the blood circulation and cells detach actively and intravasate into the blood system by undergoing an epithelial-tomesenchymal transition (EMT). These so–called circulating tumour cells (CTCs) have been shown to be key players in metastasis, the main reason for cancer–related death. Detection of CTCs in peripheral blood has been established as prognostic biomarker for poor clinical outcome in various solid cancer types. However, although two CTC detection systems achieved clinical approval, methods for CTC quantification vary widely and no standard protocol has been established yet. Most of the currently used protocols rely on the detection of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), which is expressed on epithelial CTCs, but downregulated in CTCs undergoing EMT. Consequently, the entire CTC population is not captured. In my doctoral project, I aimed at establishing a novel CTC assay for comprehensive profiling of CTCs in order to exploit the entire potential of CTCs as a liquid biomarker to predict therapy response. The AMNIS® ImageStream®X MkII (ISX) imaging flow cytometer combines the power of high–throughput flow cytometry and high–resolution microscopy and thereby enables rapid and multiparametric phenotyping of CTCs. The protocol includes two tumour markers, the pan leukocyte marker CD45 and markers exploited as therapeutic targets, such as immune checkpoint molecules (PD–L1 /–L2), activation of cancer–associated pathways (phosphorylated EGFR) or response marker for radiotherapy (gH2AX foci). By using spiking experiments and a cut–off value of >= 3 CTCs /7.5ml blood, I could demonstrate a sensitivity of 73% at a specificity of 100%. A pilot study was performed to evaluate the applicability of the ISX protocol for CTC detection in patient blood samples [head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) n=16; breast cancer (BC), n=8]. Subsequently, a larger clinical study was conducted to determine the predictive and prognostic value of CTCs in recurrent /metastatic HNSCC patients (n=54), mostly treated with immune checkpoint inhibitors (ICI). Analysis revealed no prognostic value of CTC positivity, or a concordance of PD–L1 expression between tissue and liquid biopsy. Dynamic changes of CTC counts during treatment might be a better biomarker, enabling rapid real–time assessment of treatment responses. However, evaluation in a larger and more homogenously treated patient cohort is needed before conclusion can be drawn.

Solide Tumore geben ständig Tumorzellen in den Blutkreislauf ab, welche sich aktiv ablösen und in die Blutzirkulation einwandern, indem sie eine epitheliale–mesenchymale Transition (EMT) durchlaufen. Diese sogenannten zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) spielen nachweislich eine Schlüsselrolle bei der Metastasierung, dem Hauptgrund für krebsbedingte Todesfälle. Die Quantifizierung von CTCs wurde als negativer prognostischer Biomarker bei verschiedenen soliden Krebsarten entwickelt. Obwohl zwei CTC–Detektionssysteme klinisch zugelassen sind, gibt es noch keine Standardmethode für die CTC–Quantifizierung. Die meisten dieser Protokolle beruhen auf dem Nachweis des epithelialen Zelladhäsionsmoleküls (EpCAM), das auf epithelialen CTCs exprimiert wird, aber in CTCs unter EMT herunterreguliert ist. Folglich wird nicht die gesamte CTC– Population erfasst. Ziel meines Projekts war die Etablierung eines neuen CTC–Tests zur umfassenden Charakterisierung von CTCs, um das gesamte Potenzial von CTCs als flüssiger Biomarker zur Vorhersage des Therapieansprechens auszuschöpfen. Das bildgebende AMNIS® ImageStream®X MkII (ISX) Durchflusszytometer kombiniert die Möglichkeiten der Hochdurchsatz–Durchflusszytometrie und der hochauflösenden Mikroskopie und ermöglicht so eine schnelle und multiparametrische Phänotypisierung von CTCs. Das Protokoll umfasst Marker zum Nachweis von Tumor–assoziierten Antigenen (EpCAM, EGFR), dem pan–Leukozytenmarker CD45, sowieso zur Analyse therapeutischer Targets, wie Immun–Checkpoint–Moleküle (PD–L1 /–L2), Aktivierungsstatus krebsassoziierter Signalwege (phosphorylierter EGFR) oder Ansprechmarker für Radiotherapie (􀁊H2AX foci). Mit Hilfe von Spiking–Experimenten wurde eine Sensitivität von 73% und eine Spezifität von 100% bei einem Schwellenwert 􀁙􀁒􀁑􀀃􀂕 3 CTCs /7,5 ml Blut nachgewiesen. In einer Pilotstudie wurde die Anwendbarkeit des ISX–Protokolls für den Nachweis von CTCs in Blutproben von Patienten [Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses (HNSCC) n=16; Brustkrebs, n=8)] gezeigt. Anschließend wurde eine klinische Studie durchgeführt, um den prädiktiven und prognostischen Wert von CTCs bei rezidivierten /metastasierten HNSCC–Patienten (n=54) zu ermitteln, die überwiegend mit Immun–Checkpoint–Inhibitoren (ICI) behandelt wurden. Die Analyse ergab weder einen prognostischen Wert der CTC–Positivität noch eine Übereinstimmung der PD–L1 Expression zwischen Gewebe– und Flüssigbiopsie. Dynamische Veränderungen der CTC–Zahlen während der Behandlung könnten ein besserer Biomarker sein, um eine schnelle Echtzeitbewertung des Ansprechens auf die Behandlung zu ermöglichen. Bevor jedoch Schlussfolgerungen gezogen werden können, ist eine Auswertung in einer größeren und homogeneren Patientenkohorte erforderlich.