Modulation von Vesikelparametern nach Stimulation und im Rahmen zirkadianer Rhythmik

Abstract

Zusammenfassung Synaptische Vesikel sind durch eine Reihe integraler und assoziierter Membranproteine charakterisiert, die zum einen funktionell für Speicherung und zur Freisetzung von Neurotransmittern, andererseits für die Wiedergewinnung der Membrankomponenten nach erfolgter Exozytose und Umverteilungsprozessen in der Synapse zuständig sind. Die integralen Membranproteine Synaptobrevin und Synaptophysin sind dabei allen Neurotransmitter-speichernden Vesikeln gemeinsam. In der vorliegenden Studie sollten Faktoren, die zu einer Assoziation bzw. Dissoziation des Syb-Syp- Komplexes führen, erfasst werden sowie eine mögliche zirkadiane Regulation Synaptophysins bzw. Synaptobrevins und ihrer Interaktion analysiert werden. Des Weiteren sollte mit Hilfe von Synaptophysin-Deletionsmutanten die physiologische Bedeutung Synapto-physins näher untersucht werden. Im ersten Teil der Arbeit erfolgte die Charakterisierung des Syb-Syp-Komplexes. Methodisch bediente man sich der Immunpräzipitation sowie der chemischen Quervernetzung mit DSS. Der Syb-Syp-Komplex wird Ca2+-abhängig und unter Beteiligung eines zytosolischen Faktors (F(D)) dissoziiert. Diese Dissoziation ist unabhängig von der Ca2+-Konzentration (1-1 000 μM), benötigt aber die Anwesenheit synaptosomalen Zytosols und geht dem Exozytoseprozess voraus. Das Molekulargewicht des Faktors F(D) liegt zwischen 10-30 kDa. Seine Integrität wird weder durch Frier- und Auftau-Zyklen noch durch Temperaturen bis zu 95 °C beeinträchtigt. Taipoxin und Paradoxin als Vertreter der SPAN-Familie haben eine spezifische dissoziierende Wirkung auf den Syb-Syp-Komplex an Synaptosomen (P2) sowie an synaptischen Vesikeln mit synaptosomaler, zytosolischer Komponente. An isolierten, synaptischen Vesikeln (LP2) konnte kein spezifischer SPAN-Effekt beobachtet werden. Andere SNARE-Proteine (SNAP-25, Syx) werden durch Taipoxin bzw. Paradoxin nicht beeinflusst. Die SPAN-Wirkung ist dabei Ca2+-unabhängig. Der Syb-Syp-Komplex ist auf synaptischen Vesikeln offenbar in „raft-ähnlichen“ Domänen organisiert. Während SPANs diese Struktur für Synaptobrevin nicht verändern, erfolgt für Synaptophysin und VGLUT1 eine Umverteilung innerhalb der Vesikelmembran. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass SPANs, Ca2+-unabhängig, die Neurotransmitter-Aufnahme über VMAT sowie über VGLUT vermindern. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Neurotransmitter-Aufnahme von Synaptophysin- Deletionsmutanten untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass diese im Vergleich zu Wildtypmäusen, verstärkt Neurotransmitter über VMAT und VGLUT aufnehmen. Im letzten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der zirkadianen Rhythmik auf den Syb-Syp-Komplex analysiert. Per2Brdm1-Mäuse haben im Vergleich zu Wildtypmäusen eine erhöhte Proteinkonzentration an Synaptobrevin und Synaptophysin. Während in Wildtypmäusen Synaptobrevin vermehrt als Dimer oder im Syb-Syp-Komplex vorkommt, liegt es in Per2Brdm1-Mäusen vermehrt als Monomer vor. Für Synaptophysin zeigte sich, dass in Wildtypmäusen vermehrt monomeres Synaptophysin zu finden ist, in Per2Brdm-1-Mäusen liegt es vermehrt als Dimer oder aber im Syb-Syp-Komplex gebunden vor. Die zirkadiane Regulation des Syb-Syp-Komplexes könnte ein wichtiger Mechanismus zur Gewährleistung einer geregelten Neurotransmission im Sinne der benötigten Anpassung des Organismus an seine Umwelt sein.

Abstract Synaptic vesicles are key organelles of neuronal communication. As such they concentrated in terminals of axonal processes. Synaptic vesicles store neurotransmitters, which are released by action-potential-triggered plasma membrane fusion. Synaptobrevin (syb), the most abundant vesicular protein, participates in two exclusive protein complexes. Beside the SNARE- complex, that is essential for exocytosis and additionally consists of Syntaxin and SNAP-25, synaptobrevin is also involved in the syb-syp-complex, whose function is not well understood yet. Factors leading to an association or dissociation of the syb-syp-complex were investigated in this study. In addition, a putative circadian regulation of synaptophysin (syp) and synaptobrevin was analyzed. Apart from that the physiological function of synaptophysin was specified by means of syp -/- mice. The first part of this study discusses the characterization of the syb-syp-complex. Methodically the study applied the immunoprecipitation technique in addition of chemical cross linking with DSS. The syb-syp-complex was dissociated with Ca2+ under contribution of a cytosolic factor (F(D)). This dissociation is independent of the amount of constituted Ca2+ (1-1 000 μM), but requires the presence of synaptosomal cytosol and precedes the process of exocytosis. In this study, it was shown that the factor F(D) has a molecular weight between 10 to 30 kDa and that its integrity is neither affected by freeze-thaw cycles nor by temperatures up to 95 °C. Snake presynaptic PLA2 neurotoxins (SPANs) possess a specific decreasing effect on the syb-syp-interaction on synaptosomes, as well as on synaptic vesicles in presence of cytosolic synaptosomal components. No specific effect was perceived on synaptic vesicles lacking cytosolic synaptosomal components. Other SNARE-proteins (SNAP-25, Syntaxin) are not influenced by taipoxin or paradoxin. The SPAN-effect does not depend on Ca2+. Obviously, on synaptic vesicles synaptobrevin and synaptophysin, as well as VGLUT1 are organized in raft-like domains. SPANs do not modify this structure in respect of syb, whereas syp and VGLUT1 are not longer arranged in lipid rafts after treatment with these neurotoxins. In addition, SPANs decrease the vesicular neurotransmitter uptake by VMAT or VGLUT, independently of Ca2+. In the second part of this study the vesicular uptake of neurotransmitter in syp -/- mice was investigated. Uptake via VMAT and VGLUT was shown to be enhanced in syp -/- mice compared to wild type animals. In the last part of this study, the influence of circadian rhythm on the syb-syp-complex was analyzed. In comparison to wild type mice protein levels of synaptobrevin and synaptophysin were increased in per2Brdm1 mice. While synaptobrevin appears more often as a dimer or in the syb-syp-complex in wild type mice, in per2Brdm1mice it is more often present as a monomer. In contrast, the syp monomer is increased in wild type animals, whereas in per2Brdm1 mice synaptophsyin occurs more often as dimer or in the syb-syp-complex. The circadian regulation of the syb-syp- complex could be an important mechanism to guarantee regulated neurotransmission in terms of the required adaption of an organism to its environment.