In vitro differentiated osteoclasts from human induced pluripotent stem cells as a disease model for CLCN7-related autosomal recessive osteopetrosis

Abstract

Autosomal recessive osteopetrosis (ARO) is a rare genetic bone disorder character-ised by an increase in bone mass resulting in symptoms such as anaemia, recurrent infections, growth retardation and variable central nervous system defects. Without a curative treatment with hematopoietic stem cells, patients die within the first decade of life. ARO can be caused by mutations in the CLCN7 gene coding for the Cl-/H+ ex-changer ClC-7, which is highly expressed in bone resorbing osteoclasts. Loss of ClC-7 function causes an impairement of the acidification of the osteoclast’s resorption la-cuna, which is essential for the bone remodelling process. As patient material for di-agnostic and research purpose is scarce, an adequate human disease model is of high importance. Patient-derived human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have great potential for modelling diseases as they provide an unlimited source of patient cells, which can be differentiated into disease-relevant cell types. For modelling ARO, a novel and sim-plified osteoclast differentiation technique was developed, and the obtained cells were characterised at every differentiation step. The differentiation of hiPSCs starts with em-bryoid body formation to obtain mesodermal cells and the hematopoietic specification induces the continuous production of monocyte-like cells for up to nine weeks provid-ing enough cells for several osteoclast cultures and follow-up investigations. Compar-ing primary blood monocytes with hiPSC-derived monocyte-like cells demonstrated a monocytic gene and surface marker expression in both cell types. Terminally differen-tiated osteoclasts showed the characteristic morphology, multinucleation, TRAcP ex-pression and functionality as they were able to resorb bone and dentine. In compari-son to osteoclasts differentiated from peripheral blood mononuclear cells, hiPSC oste-oclasts were larger in size with a slightly higher number of nuclei and minimal chang-es in the resorption pattern were evident. To demonstrate the ARO disease phenotype in vitro, patient-derived hiPSCs harbour-ing compound heterozygous mutations in the CLCN7 gene were differentiated into osteoclasts, which were enlarged compared to hiPSC osteoclasts from healthy donors and not able to resorb any bone or dentine. Additional functional analyses of ARO hiPSCs and the mutated ClC-7 protein revealed an enhanced level of the autophagy marker LC3-II in ARO hiPSCs and strongly reduced ion currents in the mutated chlo-ride channel despite the physiological localisation of mutated ClC-7 in lysosomes. Hence, it is assumed that patient-specific mutations result in a loss-of-function effect responsible for the severe phenotype and the death of the patient. Overall, osteopetrotic hiPSCs and this innovative osteoclast differentiation technique provide a good disease model system for ARO and could also be utilised to examine osteoclasts morphology and function in other diseases when applying to a patient-specific hiPSC line.

Autosomal-rezessive Osteopetrose (ARO) ist eine schwere genetische Knochenerkrankung, die sich durch eine erhöhte Knochenmasse auszeichnet und zu Symptomen wie Anämie, wiederkehrenden Infektionen, Wachstumsverzögerung und verschiedenen Defekten des zentralen Nervensystems führt. Falls keine kurative allogene Stammzelltransplantation erfolgt, verläuft die Krankheit innerhalb der ersten zehn Lebensjahre tödlich. ARO kann durch Mutationen im CLCN7-Gen verursacht werden, das für den Cl-/H+-Austauscher ClC-7 codiert. Dieser ist an der Bürstensaummembran von knochenresorbierenden Osteoklastenzellen hoch exprimiert und Mutationen beeinträchtigen den Ansäuerungsprozess der Resorptionslakune, welcher lebensnotwendig ist für den kontinuierlichen Knochenumbauprozess. Da primäres Patientenmaterial oft sehr limitiert ist, wird ein geeignetes ARO-Krankheitsmodell benötigt. Vom Patienten stammende humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS) stellen eine unbegrenzte Quelle von patientenspezifischen Zellen dar und können in krankheitsrelevante Zelltypen differenziert werden. Es wurde eine neuartige Methode zur hiPS-Osteoklastendifferenzierung entwickelt und detailiert charakterisiert. Die hiPS-Differenzierung wird über die Bildung von Embryoid Bodies initiiert und in die mesodermale Richtung geleitet, um anschließend mit Hilfe einer hämatopoetischen Spezifizierung die kontinuierliche Freisetzung von monozytenähnlichen Zellen hervorzurufen. Diese bis zu neun Wochen lange kontinuierliche Zellproduktion ermöglicht eine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen. Die differenzierten hiPS-Osteoklasten zeigten die zelltypischen Merkmale: a) eine hohe Anzahl an Zellkernen, b) eine positive TRAcP-Färbung und c) die Resorption von Knochen. In einem detaillierten Vergleich mit aus zirkulierenden Monozyten differenzierten Osteoklasten waren die hiPS-Osteoklasten vergrößert, wiesen eine leicht erhöhte Anzahl von Zellkernen auf und zeigten ein leicht verändertes Resorptionsmuster. Um den osteopetrotischen Phänotyp in vitro zu demonstrieren, wurden hiPS eines ARO-Patienten mit compound heterozygoten Mutationen im CLCN7-Gen zu Osteoklasten differenziert, die im Vergleich zu hiPS-Osteoklasten gesunder Spender vergrößert waren und kein Knochen resorbieren konnten. Funktionale Analysen der ARO hiPS und dem mutierten ClC-7-Protein ergaben eine erhöhte Konzentration des Autophagiemarkers LC3-II sowie stark reduzierte Ionenströme im mutierten Chloridkanal obwohl eine physiologische Lokalisierung des mutierten ClC-7 in Lysosomen detektiert wurde. Es wird daher angenommen, dass die patientenspezifischen Mutationen im CLCN7-Gen zu einem Loss-of-Function-Effekt führten, der für den schweren Phänotypen und den Tod des Patienten verantwortlich war. Insgesamt ist diese innovative Osteoklastendifferenzierungstechnik in Verbindung mit einer Patienten-hiPS Linie ein gutes in vitro Krankheitsmodell für die ARO und könnte auch bei weiteren osteoklastenbasierten Krankheiten Verwendung finden.