Towards solid-state NMR spectroscopic studies of the ETBR/ET-1 complex

Abstract

The Endothelin B receptor (ETBR) is a member of the G-protein-coupled receptor (GPCR) family of transmembrane proteins that is activated upon binding of the agonist endothelin-1 (ET-1). Endothelin receptors have distinct rank order of potencies for the ET isopeptides, but are similar in sequence. The ET isopeptides are also similar in primary sequence. Each is composed of 21 amino acids, contains two disulfide bonds and a C-terminal tryptophan residue. ET-1 and ET-2 differ by only 2 amino acids, whereas ET-3 differs by 6 amino acids from the other two. The ET receptors and peptides provide a good model for the study of peptide ligand interactions with G-protein-coupled receptors in general. A detailed understanding of the differences between the receptor subclasses, however, requires structural information at atomic resolution. Understanding the differences responsible for the ETA and ETB receptors different pharmacological properties will likely aid in the design of drugs that more specifically affect only a desired subclass of receptors. The overall goal of this work is to contribute to the solution of the first structure of a receptor-bound endothelin. To this end, the structure of human ET-1 bound to the ETBR should be determined by solid-state NMR techniques. For high resolution solid-state NMR large amounts (mg scale) of purified receptor- ligand complex will be required. Important steps to meet this goal represent the identification and evaluation of heterologous protein expression systems for human ET-1 as well as for human ETBR. Due to the low natural abundance of the ETBR, it cannot be purified in large amounts from natural sources and an expression system was sought which offers the potential to provide sufficient quantities of recombinant functional receptor to permit structural studies. Eukaryotic expression systems offer the possibility of expression of functional receptor, which pass through post-translational processing similar to that experienced in the context of the native receptor. One promising approach is the receptor expression using the baculovirus system. As inspired by previous reports an efficient expression system for subsequent purification of the ETBR/ET-1 complex should be established. Doi et al. (1997) reported the high-yield insect-cell expression and purification of human ETBR (spinner system, 0.5 mg/3 l culture, 100 pmol/mg). The expression has been optimized with regard to harvest time and multiplicity of infection (MOI). For receptor production Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with a MOI of 0.1 with the recombinant baculoviruses. Shaker culture at the 0.5-L scale was used to obtain protein material. The maximal peak of receptor production was reached at 72-96 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed about 7 pmol of active receptor/ mg of membrane protein. The recombinant receptor was expressed at low level, but exhibits similar pharmacological properties as ETBR expressed in mammalian cells. Cholesterol levels in Sf9 insect cells were not a limiting factor in the expression of a high affinity ETBR. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing ligand-free receptor was evaluated. Further efforts in this direction will be necessary. The cellular localization of the GFP-tagged ETBR was investigated using confocal laser microscopy. From laser scan microscopy experiments with the ETB-GFP fusion expressed in Sf9 cells, it seems that a part of the receptor expressed is located in the endoplasmic reticulum. As alternative to the baculovirus system, a P. pastoris heterologous expression system was then used (kindly provided by Dr. H. Reiländer and Prof. Dr. H. Michel (MPI of Biophysics, Frankfurt am Main)). In order to obtain >10 mg of purified receptor for structural investigations, the FlagHisETBBio receptor construct was expressed using 24-L shaker culture techniques on a weekly basis. Since binding of the ligand renders the receptor more stable and less prone to aggregation (Doi et al., 1997), the receptor was purified in complex with synthetic isotope labelled ET-1. [13CO 7, 12, 14; 15Na 19, 20]-ET-1 was prepared by solid phase synthesis. In practice we generally required 20-30 mg of labeled ET-1 to purify 10 mg of receptor. Altogether, we have been able to purify about 10 mg of pure recombinant ETBR/ ET-1 complex from 140 l yeast shaking culture in several batches. Besides, the original purification protocol was modified by introducing one additional ultracentrifugation step which should allow to recover the excess ET-1 as unbound supernatant and to reuse it in the next purification cycle. In the final step, during the concentration of the receptor sample for solid-state NMR studies by ultracentrifugation, receptor precipitates formed A prerequisite to solid state NMR measurement of ligands bound to their receptors is the introduction of NMR sensitive isotopes into the ligand. Our solid-state NMR approach (Castellani et al., 2002) requires the synthesis of several isotope-labelled ET-1 variants. These should be produced using the recombinant E. coli expression system for subsequent receptor purification from P. pastoris. The construct TrxXaET-1, which encodes a cleavable fusion of ET-1 to thioredoxin, yielded an expression level of 60-80 mg active ET-1 fusion protein/ l shaking culture. The expression level of the same clone in fermenter culture was slightly lower, and from a 10 l fermenter it was possible to obtain about 40 g of cells that contained about 400 mg of fusion protein. This novel expression methodology allows production of ET-1 in the milligram order from 1 l culture which permits NMR studies of the ligand whilst bound to the receptor. ET-1 has been characterized by several biophysical techniques including NMR, mass spectroscopy and reverse phase HPLC. Finally, two ET-1/ETBR preparations were analyzed by ssNMR: (1) 13CO (Met7, 12, Phe14), 15N (Ile19, Ile20) ET-1 in complex with detergent solubilized receptor from P. pastoris and (2) uniformly 13C,15N labelled ET-1 in complex with detergent solubilized receptor from Sf9 cells. Solid state NMR 1D CP/MAS experiments were carried out on frozen solution of the complex of the 21-residue [13CO 7, 12, 14; 15Na 19, 20]-ET-1 bound to the detergent solubilized ETBR (10 nmol) from P. pastoris. It was possible to specifically observe 13CO labels of ET-1 whilst bound to the receptor. However, distance measurements were hindered by the inability to resolve the individual 13CO resonances within ET-1, by the low intensity due to the low receptor amount and by the long distances between 13C,15N pairs. As a prelude to a full assignment of ET-1 bound to the receptor, a complete assignment of the uniformly 13C, 15N-labelled ET-1 backbone (Cα, Cβ, N and HN) under solution conditions was hence carried out based on the CBCA(CO)NH and HNCACB spectra. 2D MAS 13C-13C correlation spectrum was obtained for the uniformly 13C, 15N-enriched ET-1 whilst bound to the purified ETBR (80 nmol) from Sf9 cells, which was purified by A. Srivastava (MPI of Biophysics, Frankfurt am Main). The 2D 13C-13C correlation spectrum of bound ET-1 had sufficient resolution to identify, to correlate and to assign many backbone and side chain chemical shifts for the majority of sites simply by comparison with solution shifts. A few residues were ambiguously assigned and correspond to regions previously reported to be mobile on the basis of solution NMR studies. A few additional sites exhibit shifts that differ from the solution NMR assignments. Nonetheless, these preliminary assignments indicate close agreement between the chemical shifts observed for unbound ET-1 in solution and those for bound ET-1 in the solid state.

Der Endothelin B Rezeptor (ETBR) ist ein Transmembranprotein und zählt zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. ETBR wird durch Bindung des Agonisten Endothelin-1 (ET-1) aktiviert. Endothelin-Rezeptoren zeigen zwar unterschiedliche Affinitäten für Endotheline, ähneln sich jedoch in der Sequenz. Auch die Endotheline sind in ihrer Primärsequenz ähnlich: Jedes besteht aus 21 Aminosäuren, besitzt zwei Disulfidbrücken und einen C-terminalen Tryptophanrest. ET-1 und ET-2 unterscheiden sich nur in 2 Aminosäuren, während ET-3 sich von den anderen zwei in 6 Aminosäuren unterscheidet. ET Rezeptoren stellen daher ein gutes Modell dar, um die Peptidligandenwechselwirkung mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren im allgemeinen zu untersuchen. Ein detailiertes Verständnis der Rezeptorsubklassenunterschiede erfordert Strukturinformation auf atomarer Ebene. Die Kenntnisse der Unterschiede, die für unterschiedliche pharmakologische Eigenschaften des ETA- oder ETB-Rezeptors verantwortlich sind, könnte die Entwicklung von Pharmaka unterstützen, die selektiv an einer gewünschten Rezeptorsubklasse wirken. Das allgemeine Ziel dieser Arbeit besteht darin, einen Beitrag zur Lösung der ersten Struktur des ET-1 im rezeptorgebundenen Zustand zu leisten. Zu diesem Zweck soll die Struktur des humanen ET-1, welches an den ETBR gebunden ist, mit Hilfe von Festkörper NMR Techniken bestimmt werden. Für die hochauflösende Festkörper NMR Spektroskopie wird eine Milligramm-Menge an aufgereinigtem Rezeptor-Liganden Komplex benötigt. Um dieses Ziel zu erreichen, sollen heterologe Proteinexpressionssysteme sowohl für das humane ET-1 als auch für den humanen ETBR identifiziert und evaluiert werden. Da sich aufgrund der niedrigen zellulären Abundanz des ETBR eine Reinigung aus Primärgewebe ausschließt, wurde ein rekombinantes Expressionssystem gesucht, daß das Potenzial bietet, funktionellen Rezeptor in ausreichender Menge für Strukturuntersuchungen zu gewinnen. Eukaryontische Expressionssysteme ermöglichen (nahezu) native posttranslationale Prozessierung des exprimierten Rezeptors. Ein vielversprechender Ansatz hierzu ist das Baculovirussystem. Basierend auf Publikationsdaten sollte ein effizientes Expressionssystem für die Aufreinigung des ETBR/ET-1 Komplexes etabliert werden. Doi & Kollegen, 1997 berichteten über hohe Ausbeute an aufgereinigtem und exprimiertem ETBR aus Insektenzellen ( Spinner-System , 0.5 mg/ 3 l Kultur, 100 pmol/mg). Die Expression wurde hinsichtlich Zeitpunkt und Multiplizität der Infektion (MOI) optimiert. Für die Rezeptorproduktion wurden Sf9 (S. frugiperda) Suspensionszellen mit einer MOI von 0,1 mit rekombinanten Baculoviren infiziert und Proteinmaterial aus Schüttelkulturen im 0,5 l Maßstab gewonnen. Das Maximum der Rezeptorproduktion wurde 72-96 h nach Infektion erhalten. Mittels radioaktiver Ligandenbindungsassays wurden ungefähr 7 pmol aktiver Rezeptor/mg Membranprotein erhalten. Die Expressionsausbeute war zwar niedrig, jedoch zeigte der rekombinante Rezeptor ähnliche pharmakologische Eigenschaften wie der in Säugerzellen exprimierte ETBR. Die Cholesterolmenge in Sf9 Insektenzellen stellt keinen limitierenden Faktor bei der Expression einen hochaffinen ETBR dar. Anschließend wurde die Effizienz verschiedener Detergenzien zur Solubilisierung des exprimierten Rezeptors evaluiert. Weitere Bemühungen in dieser Richtung sind notwendig. Darüberhinaus wurde die zelluläre Lokalisation von GFP-markierten ETBR mittels konfokaler Lasermikroskopie untersucht. Fluoreszenzmikroskopische Ergebnisse deuten darauf hin, daß sich ein Teil des exprimierten Rezeptors im endoplasmatischen Retikulum befand. Als Alternative zum Baculovirussystem wurde des Weiteren ein Expressionssystem in P. pastoris verwendet (freundlicherweise von Dr. H. Reiländer und Prof. Dr. H. Michel (MPI für Biophysik, Frankfurt am Main) zur Verfügung gestellt). Um mehr als 10 mg an aufgereinigtem Rezeptor für Strukturuntersuchungen zu erhalten, wurde das Konstrukt FlagHisETBBio im wöchentlichen 24 l Schüttelkultur Maßstab exprimiert. Da ETBR im ligandengebundenen Zustand als stabiler und weniger aggregationsanfällig beschrieben ist (Doi & Kollegen, 1997), wurde der Rezeptor als Komplex mit synthetischem isotopenmarkierten ET-1 aufgereinigt. [13CO 7, 12, 14; 15Na 19, 20]-ET-1 wurde über Festphasensynthese hergestellt. 20 bis 30 mg an markiertem ET-1 wurden für die Aufreinigung von 10 mg FlagHisETBBio Rezeptor benötigt. Insgesamt konnten ungefähr 10 mg ETBR/ET-1 Komplex aus mehreren Hefeschüttelkulturen (140 l) aufgereinigt werden. Dabei wurde das ursprüngliche Aufreinigungsprotokoll durch einen zusätzlichen Ultrazentrifugationsschritt modifiziert, so daß überschüssiges ungebundenes ET-1 im Überstand für die nächste Aufreinigungsrunde wieder gewonnen werden konnte. Im finalen Schritt, der Konzentrierung der Rezeptorprobe für Festkörper-NMR-Studien mittels Ultrazentrifugation, entstanden jedoch Rezeptorpräzipitate. Eine wesentliche Voraussetzung für Festkörper-NMR- Messungen von rezeptorgebundenen Liganden ist die Markierung des Liganden mit NMR-empfindlichen Isotopen. Unsere Festkörper NMR-Methodik (Castellani & Kollegen, 2002) benötigt die Synthese von mehreren isotopenmarkierten ET-1 Varianten. Diese sollten im rekombinanten E. coli Expressionssystem produziert werden und anschließend zur Aufreinigung des ETB Rezeptors aus P. pastoris verwendet werden. Mit Hilfe des Konstruktes TrxXaET-1, das eine Faktor Xa spaltbare Fusion des Endothelins an Thioredoxin kodiert, lieferte ein Expressionslevel von 60-80 mg/l an aktivem ET-1 Fusionsprotein in Schüttelkultur. Obwohl das Expressionslevel desselben Klons in der Fermenterkultur niedriger war, wurden aus 10 l Fermentation 40 g Zellen erhalten, 400 mg an Fusionsprotein entsprechend. Diese neue Expressionsmethodik ermöglichte die Produktion von ET-1 im Milligramm-Maßstab aus 1 l Kultur, um NMR Untersuchungen des rezeptorgebundenen Liganden durchzuführen. ET-1 wurde durch mehrere biophysikalische Techniken inklusive NMR, Massenspektrometrie und RP-HPLC charakterisiert. Schließlich wurden zwei ET-1/ETBR Präparationen mit Festkörper-NMR analysiert: (1) 13CO (Met7,12, Phe14),15N (Ile19, Ile20) ET-1 gebunden an solubilisiertem Rezeptor aus P. pastoris und (2) uniform markiertes 13C,15N ET-1, welches an solubilisiertem Rezeptor aus Sf9-Zellen gebunden ist. Festkörper NMR 1D CP/MAS wurde mit dem eingefrorenen Komplex aus 13CO (Met7, 12, Phe14),15N (Ile19, Ile20) ET-1 und solubilisiertem Rezeptor (10 nmol) gemessen. 13CO Markierungen am gebundenen ET-1 konnte beobachtet werden, jedoch waren Abstandsmessungen nicht möglich wegen der Unauflösbarkeit der individuellen 13CO Resonanzen, niedriger Signalintensität und aufgrund der großen Abstände zwischen den 13C, 15N Paaren. Als erster Schritt zur vollständigen Zuordnung von rezeptorgebundenem ET-1 wurde eine vollständige Zuordnung des Rückgrats des uniform 13C, 15N- markiertem ET-1 (Cα, Cβ, N und HN) mit Lösungs-NMR, basierend auf CBCA(CO)NH und HNCACB Spektren, durchgeführt. Ein 2D MAS 13C-13C Korrelationsspektrum wurde für uniform markiertes 13C, 15N-angereichertes ET-1 in Komplex mit aufgereinigtem Rezeptor (80 nmol) aus Sf9 Zellen aufgenommen. Dieser Rezeptor wurde von A. Srivastava (MPI für Biophysik, Frankfurt am Main) aufgereinigt. Das 2D 13C-13C Spektrum von gebundenem ET-1 zeigte genügend Auflösung, um mehrheitlich viele chemische Verschiebungen des Rückgrats und der Seitenketten durch einfachen Vergleich mit NMR in Lösung Verschiebungen zu identifizieren, zu korrelieren und zu zuordnen. Wenige Verschiebungen waren zweideutig zugeordnet and entsprachen Regionen, von denen vorher aufgrund von Lösungs- NMR- Studien berichtet wurde, dass sie beweglich seien. Ein paar wenige Zusatzstellen zeigten Verschiebungen, die sich von Zuordnungen der NMR in Lösung unterscheiden. Diese Zuordnungen weisen auf ungefähre Übereinstimmung der chemischen Verschiebungen des ungebundenen ET-1 in Lösung mit den Verschiebungen des gebundenen ET-1 im Festkörper hin.