Proteinbiochemische Charakterisierung von Antigenen pathogener Prototheken- Spezies

Abstract

Prototheken sind einzellige, saprophytisch lebende Algen. Obwohl sie phylogenetisch der Gruppe der Grünalgen angehören, sind diese Mikroorganismen chlorophylllos und besitzen damit einen obligat heterotrophen Stoffwechsel. Kulturmorphologisch ähneln sie Hefen der Gattung Candida, können von diesen aber mikroskopisch leicht durch die fehlende Sprossung unterschieden werden. Prototheken weisen eine asexuelle Vermehrung durch die Bildung endogener Tochterzellen auf. Medizinisch und veterinärmedizinisch sind die Mikroalgen von Bedeutung, da einige Arten Infektionen (sogenannt Protothekosen) beim Mensch und Tier hervorrufen. Dabei verfügen Prototheken über alle Voraussetzungen, die hochpathogene Erreger benötigen: eine stabile und strapazierfähige Zellwand, Widerstandfähigkeit gegenüber physikalischem, chemischem oder mechanischem Stress, Ausbildung von Dauersporen und limitierte Behandlungsmöglichkeiten. Trotz allem sind Protothekosen sehr seltene Erkrankungen. Der jeweilige Erreger sowie Verlauf und Lokalisation der Erkrankung variieren dabei zwischen den verschiedenen Wirtsspezies. Protothekosen können sowohl lokal begrenzt auftreten, häufig in Form kutaner oder subkutaner Manifestation, oder einen disseminierten Verlauf nehmen. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenese sind dabei noch weitgehend unbekannt. Um Grundlagen zum Verständnis des Infektionsverlaufes zu schaffen, sollten in dieser Arbeit immunreaktive Proteine von Prototheca zopfii GT2 durch Western Blot Analysen detektiert und mittels MALDI-TOF MS identifiziert werden. Im ersten Abschnitt wurden hierfür Seren experimentell infizierter Kaninchen verwendet. Mit den enthaltenen Antikörpern konnten im Western Blot 24 antigene Proteine von P. zopfii GT2 detektiert werden, welche auch für die weiterführende Analyse per MALDI-TOF MS genutzt wurden. Davon gelang im Folgenden die Identifikation von 15 Proteinen. Bei diesen handelte es sich vorrangig um regulatorische Proteine und Enzyme des Stoffwechsels. Einige dieser Proteine (Malatdehydrogenase (MDH), Hitzeschockprotein 70 (Hsp70), Elongationsfaktor 1-alpha (EF-1α), 14-3-3 Protein) sind als immunreaktive Proteine anderer eukaryotischer Pathogene bekannt. Weiter wurde auch die Kreuzreaktivität der leporinen anti-P. zopfii GT2 Seren mit Proteinen von P. zopfii GT1 und P. blaschkeae getestet. Diese erwies sich als sehr hoch. 48 der kreuzreaktiven Proteine konnten ebenfalls per MALDI-TOF MS bestimmt werden. ATPase, MDH, EF-1α, Hsp70 wurden bei allen untersuchten Spezies bzw. Genotypen als antigene Proteine identifiziert. Im zweiten Abschnitt wurden analoge Untersuchungen anhand natürlicher caniner Infektionsseren durchgeführt. Auch hier konnte eine sehr starke Kreuzreaktivität verzeichnet werden. Insgesamt wurden 198 Proteinspots mittels MALDI-TOF MS analysiert. Für 86 Proteine gelang eine Identifikation. Auch hier handelte es sich zum größten Teil um Proteine der Regulation, Replikation, Proteinexpression und um enzymatische Stoffwechselproteine. Auffällig ist, dass auch hier MDH, Hsp70, EF-1α und ein 14-3-3 Protein als immunreaktive Proteine nachgewiesen wurden. Diese spielen auch eine Rolle bei Infektionen mit den eukaryotischen Erregern Anisakis sp. Schistosoma sp. und Cryptococcus sp. Außerdem wurden Glyceraldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase (GAPDH), Triosephosphatisomerase, Enolase und Succinyl-CoA Synthetase als antigene Proteine bestimmt. Diesen sogenannten Housekeeping- Enzymen kommt bei einer Reihe von Pathogenen eine gesonderte Rolle als oberflächenassoziierte Virulenzfaktoren zu. In ersten Untersuchungen konnte in der vorliegenden Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass GAPDH an der Zelloberfläche von P. blaschkeae exprimiert wird. Dies legt die Vermutung nahe, dass GAPDH am Infektionsgeschehen von P. blaschkeae bei der bovinen Protothekenmastitis beteiligt ist und dass P. zopfii GT2 möglicherweise über andere oberflächenassoziierte Stoffwechselenzyme verfügt. Weiterführende Untersuchungen bezüglich der Beteiligung von Enzymen am Infektionsgeschehen durch ihre Aktivität an der Zelloberfläche werden dringend benötigt.

Prototheca spp. are unicellular, saprophytically living algae. Although these microorganisms belong to the phylogenetic group of the green algae, they are colorless due to the absence of chlorophyll. Therefore their metabolism is characterized as obligate heterotrophic. Macroscopically they bear a likeness to yeasts of the genus Candida but the algae can be differentiated from them easily under the microscope because they show no budding. Prototheca reproduce asexually by the formation of endogenous daughter cells. They are of medical and veterinary interest as some of the Prototheca species are associated with infections in humans and animals, known as protothecosis. They fulfill all qualifications to be highly pathogenic: a strong and resilient cell wall, resistance against physical, chemical and mechanical stress, formation of a resting cell stage and limited treatment options. However, protothecosis is a relatively rare disease. The pathogenic agent, the pathogenicity as well as the localization of the infection vary between the different host species. Protothecosis may occur as local infection for example as cutaneous manifestation but can run a disseminated course. There is little known about the underlying mechanisms of pathogenicity. To lay the basis of understanding the course of infection, the aim of this thesis was to determine immunoreactive proteins of Prototheca zopfii GT2 by western blot analysis and identify those using MALDI TOF MS. In the first part of this work, western blot analysis was used to identify immunodominant protein spots using sera of experimentally infected rabbits. With these 24 immunoreactive proteins of P. zopfii GT2 were detected, from which 15 proteins could be identified by MALDI TOF MS. Most of these proteins were proteins of regulatory functions and enzymes of the metabolism. Some of them - malate dehydrogenase (MDH), heat shock proteins 70 (Hsp70), elongation factor 1-α, (EF-1α) and 14-3-3 protein – are known as immunoreactive proteins from other eukaryotic pathogens. Further crossreactivity of the sera with proteins from P. zopfii GT1 and P. blaschkeae was tested with a high success rate. 48 of these crossreactive proteins could be determined using MALDI TOF MS, too. ATPase, MDH, EF-1α and Hsp70 were identified from western blot analysis of all tested strains. In the second part of this PhD thesis, experiments with sera from naturally infected dogs were performed as above. The canine sera display a marked crossreactivity between different species and genotypes, too. Taken together 198 proteins spots were analyzed by MALDI TOF MS from which 86 were identified. Comparable with the leporine sera, the main part of the immunoreactive proteins obtained with canine infection sera were proteins of regulation, replication, protein expression and metabolic enzymes. It is noticeable that MDH, Hsp70, EF-1α and 14-3-3 protein were also found as immunoreactive proteins. These are involved in pathogenicity of the eukaryotic pathogens Anisakis sp., Schistosoma sp. and Cryptococcus sp. Further glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), triosephosphate isomerase, enolase and succinyl-CoA synthetase could be determined as antigenic proteins. These so-called housekeeping enzymes are of special functions as surface-associated virulence factors in a number of pathogens. In this thesis, for the first time, the presence of GAPDH on the surface of Prototheca spp. was demonstrated using FACS analysis. It was shown that GAPDH is expressed on the surface of P. blaschkeae. This implies the assumption that GAPDH could be involved in the pathogenicity of P. blaschkeae causing bovine mastitis. It is also possible that P. zopfii GT2 disposes of other surface associated metabolic enzymes than GAPDH. It is strongly recommend that additional investigations be carried out to confirm the expression of these identified enzymes on the surface of Prototheca cells and ascertain their role in the infection process.