dc.contributor.author
Irrgang, Alexandra
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:01:20Z
dc.date.available
2016-08-04T13:03:53.653Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4531
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8731
dc.description.abstract
Prototheken sind einzellige, saprophytisch lebende Algen. Obwohl sie
phylogenetisch der Gruppe der Grünalgen angehören, sind diese Mikroorganismen
chlorophylllos und besitzen damit einen obligat heterotrophen Stoffwechsel.
Kulturmorphologisch ähneln sie Hefen der Gattung Candida, können von diesen
aber mikroskopisch leicht durch die fehlende Sprossung unterschieden werden.
Prototheken weisen eine asexuelle Vermehrung durch die Bildung endogener
Tochterzellen auf. Medizinisch und veterinärmedizinisch sind die Mikroalgen
von Bedeutung, da einige Arten Infektionen (sogenannt Protothekosen) beim
Mensch und Tier hervorrufen. Dabei verfügen Prototheken über alle
Voraussetzungen, die hochpathogene Erreger benötigen: eine stabile und
strapazierfähige Zellwand, Widerstandfähigkeit gegenüber physikalischem,
chemischem oder mechanischem Stress, Ausbildung von Dauersporen und limitierte
Behandlungsmöglichkeiten. Trotz allem sind Protothekosen sehr seltene
Erkrankungen. Der jeweilige Erreger sowie Verlauf und Lokalisation der
Erkrankung variieren dabei zwischen den verschiedenen Wirtsspezies.
Protothekosen können sowohl lokal begrenzt auftreten, häufig in Form kutaner
oder subkutaner Manifestation, oder einen disseminierten Verlauf nehmen. Die
zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenese sind dabei noch weitgehend
unbekannt. Um Grundlagen zum Verständnis des Infektionsverlaufes zu schaffen,
sollten in dieser Arbeit immunreaktive Proteine von Prototheca zopfii GT2
durch Western Blot Analysen detektiert und mittels MALDI-TOF MS identifiziert
werden. Im ersten Abschnitt wurden hierfür Seren experimentell infizierter
Kaninchen verwendet. Mit den enthaltenen Antikörpern konnten im Western Blot
24 antigene Proteine von P. zopfii GT2 detektiert werden, welche auch für die
weiterführende Analyse per MALDI-TOF MS genutzt wurden. Davon gelang im
Folgenden die Identifikation von 15 Proteinen. Bei diesen handelte es sich
vorrangig um regulatorische Proteine und Enzyme des Stoffwechsels. Einige
dieser Proteine (Malatdehydrogenase (MDH), Hitzeschockprotein 70 (Hsp70),
Elongationsfaktor 1-alpha (EF-1α), 14-3-3 Protein) sind als immunreaktive
Proteine anderer eukaryotischer Pathogene bekannt. Weiter wurde auch die
Kreuzreaktivität der leporinen anti-P. zopfii GT2 Seren mit Proteinen von P.
zopfii GT1 und P. blaschkeae getestet. Diese erwies sich als sehr hoch. 48 der
kreuzreaktiven Proteine konnten ebenfalls per MALDI-TOF MS bestimmt werden.
ATPase, MDH, EF-1α, Hsp70 wurden bei allen untersuchten Spezies bzw. Genotypen
als antigene Proteine identifiziert. Im zweiten Abschnitt wurden analoge
Untersuchungen anhand natürlicher caniner Infektionsseren durchgeführt. Auch
hier konnte eine sehr starke Kreuzreaktivität verzeichnet werden. Insgesamt
wurden 198 Proteinspots mittels MALDI-TOF MS analysiert. Für 86 Proteine
gelang eine Identifikation. Auch hier handelte es sich zum größten Teil um
Proteine der Regulation, Replikation, Proteinexpression und um enzymatische
Stoffwechselproteine. Auffällig ist, dass auch hier MDH, Hsp70, EF-1α und ein
14-3-3 Protein als immunreaktive Proteine nachgewiesen wurden. Diese spielen
auch eine Rolle bei Infektionen mit den eukaryotischen Erregern Anisakis sp.
Schistosoma sp. und Cryptococcus sp. Außerdem wurden Glyceraldehyd-3-phosphat-
Dehydrogenase (GAPDH), Triosephosphatisomerase, Enolase und Succinyl-CoA
Synthetase als antigene Proteine bestimmt. Diesen sogenannten Housekeeping-
Enzymen kommt bei einer Reihe von Pathogenen eine gesonderte Rolle als
oberflächenassoziierte Virulenzfaktoren zu. In ersten Untersuchungen konnte in
der vorliegenden Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass GAPDH an der
Zelloberfläche von P. blaschkeae exprimiert wird. Dies legt die Vermutung
nahe, dass GAPDH am Infektionsgeschehen von P. blaschkeae bei der bovinen
Protothekenmastitis beteiligt ist und dass P. zopfii GT2 möglicherweise über
andere oberflächenassoziierte Stoffwechselenzyme verfügt. Weiterführende
Untersuchungen bezüglich der Beteiligung von Enzymen am Infektionsgeschehen
durch ihre Aktivität an der Zelloberfläche werden dringend benötigt.
de
dc.description.abstract
Prototheca spp. are unicellular, saprophytically living algae. Although these
microorganisms belong to the phylogenetic group of the green algae, they are
colorless due to the absence of chlorophyll. Therefore their metabolism is
characterized as obligate heterotrophic. Macroscopically they bear a likeness
to yeasts of the genus Candida but the algae can be differentiated from them
easily under the microscope because they show no budding. Prototheca reproduce
asexually by the formation of endogenous daughter cells. They are of medical
and veterinary interest as some of the Prototheca species are associated with
infections in humans and animals, known as protothecosis. They fulfill all
qualifications to be highly pathogenic: a strong and resilient cell wall,
resistance against physical, chemical and mechanical stress, formation of a
resting cell stage and limited treatment options. However, protothecosis is a
relatively rare disease. The pathogenic agent, the pathogenicity as well as
the localization of the infection vary between the different host species.
Protothecosis may occur as local infection for example as cutaneous
manifestation but can run a disseminated course. There is little known about
the underlying mechanisms of pathogenicity. To lay the basis of understanding
the course of infection, the aim of this thesis was to determine
immunoreactive proteins of Prototheca zopfii GT2 by western blot analysis and
identify those using MALDI TOF MS. In the first part of this work, western
blot analysis was used to identify immunodominant protein spots using sera of
experimentally infected rabbits. With these 24 immunoreactive proteins of P.
zopfii GT2 were detected, from which 15 proteins could be identified by MALDI
TOF MS. Most of these proteins were proteins of regulatory functions and
enzymes of the metabolism. Some of them - malate dehydrogenase (MDH), heat
shock proteins 70 (Hsp70), elongation factor 1-α, (EF-1α) and 14-3-3 protein –
are known as immunoreactive proteins from other eukaryotic pathogens. Further
crossreactivity of the sera with proteins from P. zopfii GT1 and P. blaschkeae
was tested with a high success rate. 48 of these crossreactive proteins could
be determined using MALDI TOF MS, too. ATPase, MDH, EF-1α and Hsp70 were
identified from western blot analysis of all tested strains. In the second
part of this PhD thesis, experiments with sera from naturally infected dogs
were performed as above. The canine sera display a marked crossreactivity
between different species and genotypes, too. Taken together 198 proteins
spots were analyzed by MALDI TOF MS from which 86 were identified. Comparable
with the leporine sera, the main part of the immunoreactive proteins obtained
with canine infection sera were proteins of regulation, replication, protein
expression and metabolic enzymes. It is noticeable that MDH, Hsp70, EF-1α and
14-3-3 protein were also found as immunoreactive proteins. These are involved
in pathogenicity of the eukaryotic pathogens Anisakis sp., Schistosoma sp. and
Cryptococcus sp. Further glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH),
triosephosphate isomerase, enolase and succinyl-CoA synthetase could be
determined as antigenic proteins. These so-called housekeeping enzymes are of
special functions as surface-associated virulence factors in a number of
pathogens. In this thesis, for the first time, the presence of GAPDH on the
surface of Prototheca spp. was demonstrated using FACS analysis. It was shown
that GAPDH is expressed on the surface of P. blaschkeae. This implies the
assumption that GAPDH could be involved in the pathogenicity of P. blaschkeae
causing bovine mastitis. It is also possible that P. zopfii GT2 disposes of
other surface associated metabolic enzymes than GAPDH. It is strongly
recommend that additional investigations be carried out to confirm the
expression of these identified enzymes on the surface of Prototheca cells and
ascertain their role in the infection process.
en
dc.format.extent
IV, 79 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
virulence factors
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Proteinbiochemische Charakterisierung von Antigenen pathogener Prototheken-
Spezies
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Uwe Rösler
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Thomas Alter
dc.contributor.furtherReferee
PD Dr. Karsten Nöckler
dc.date.accepted
2016-06-15
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000102497-3
dc.title.translated
Biochemical characterization of antigenic proteins from pathogenic Prototheca
species
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000102497
refubium.note.author
Mensch und Buch Verlag; Aus Copyrightgründen ist ein Zeitschriftenartikel hier
nicht online veröffentlicht.
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FUDISS_derivate_000000019555
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open access