Modeling the properties and function of the enzymic cofactor vitamin B6 by NMR

Abstract

Pyridoxal 5’-phosphate (PLP) belongs to the vitamin B6 group and serves as a cofactor in a wide variety of enzymes. PLP forms an internal Schiff base (SB) with the epsilon-amino group of a lysine residue of the enzyme. The incoming substrate reacts with the internal SB and displaces the lysine residue of the enzyme by forming an external SB. This reaction, named transimination, which is still not fully understood to this day, is the starting point of the catalytic cycle of all PLP-dependent enzymes. The aim of this thesis is to extend the knowledge of the transimination mechanism powered by PLP. Therefore, multinuclear NMR studies of i) PLP alone; ii) PLP species in aqueous solution (i.e. products of PLP with diaminopropane and L-lysine) in aqueous solution; iii) PLP with poly-L-lysine in solid state and; iii) the enzymic particular case of alanine racemase have been performed. 13C NMR spectra of 13C-enriched PLP in the C-4’ and C-5’ positions in water as a function of pH have been recorded as low as pH 1. From the dependence of the 13C chemical shifts on pH, the pKa values of PLP could be determined. In particular, the heretofore uncharacterized protonation state of the fully protonated PLP has been analyzed. The corresponding pKa value of 2.4 indicates that the phosphate group is solely involved in the first deprotonation step. Moreover, 15N NMR chemical shifts show the tautomerism in the different protonation states of PLP. pH-dependent 1H, 13C, and 15N NMR spectra of PLP mixed with equal amounts of either doubly 15N labeled diaminopropane, 15N-α-L-lysine or 15N-ε-L-lysine as model systems for intermediates of the transimination were measured. At low pH, only the separate reactants are observed. Above pH 4, the single- and double-headed SBs are observed. At high pH, a geminal diamine is formed with diaminopropane, but not with L-lysine. Whereas the SB with the α-amino group decomposes again at high pH, the SB with the ε-amino group is stable until pH 12. From the NMR spectra both the mole fractions of the different PLP species as well as their pKa values are extracted. Up to 6 different protonation states could be identified for each PLP species. Moreover, the data analysis shows that all SBs are subject to a proton tautomerism along the intramolecular OHN hydrogen bond. Around pH 7, all major PLP species are present in similar amounts which is associated to a subtle balance of the acid-base properties of the functional groups. Dry and hydrated lyophilized samples of alanine racemase enriched with 15N-PLP were studied by solid state NMR. The distance between the ring nitrogen of PLP and one of the guanidinium nitrogens of Arg219 within the active site was estimated to 3.01 Å. In addition, the equilibrium constant of the tautomerism between the enolimine and the iminophenoxide forms can be shifted by adding water as observed by the high-field shift of the 15N NMR signal of the pyridine ring inside the hydrated alanine racemase. This effect is supported by the observation of the same behavior of PLP species in poly-L-lysine. The modeling of properties and functions of the enzymic cofactor PLP by NMR demonstrates the critical importance of the SB tautomerism for the activation of the internal SB, which triggers transimination. Transimination was found to be more favorable to proceed via microsolvation of the SB than via the geminal diamine pathway. This microsolvation leads to hydrolysis of the PLP SB liberating the aldehyde form of PLP which condenses with another amino group thus performing the transimination reaction.

Pyridoxal 5’-Phosphat (PLP) gehört zur Vitamin B6 Gruppe und dient als Cofaktor in einer Vielzahl von Enzymen. PLP ist durch die Bildung einer internen Schiff’schen Base (SB) mit der epsilon-Aminogruppe eines Lysinrests kovalent an das Enzym gebunden. Das Substrat reagiert mit der internen SB und ersetzt den Lysinrest des Enzyms durch die Bildung einer externen SB. Diese bis heute nicht vollständig verstandene Reaktion wird als Transiminierung bezeichnet und ist der Ausgangspunkt des katalytischen Zyklus aller PLP- getriebenen Enzyme. Das Ziel dieser Arbeit ist die Erweiterung der wissenschaftlichen Erkenntnisse über den PLP-getriebenen Mechanismus der Transiminierung durch NMR-Untersuchungen. 13C NMR Spektren von in der C-4’ und C-5’ Position 13C-angereichertem PLP in Wasser wurden als Funktion des pH- Wertes bis zu einem pH-Wert von 1 aufgezeichnet und daraus die pKa-Werte von PLP bestimmt. Insbesondere wurde der bisher uncharakterisierte Protonierungszustand des vollständig protonierten PLP untersucht. Der pKa-Wert von 2,4 weist darauf hin, dass die Phosphatgruppe lediglich im ersten Deprotonierungsschritt involviert ist. Die 15N NMR chemischen Verschiebungen zeigen die Tautomerie in den verschiedenen Protonierungszuständen von PLP. In pH-abhängigen 1H, 13C, und 15N NMR Spektren von Modellsyteme (PLP, zu gleichen Anteilen gemischt mit doppelt 15N-markiertem Diaminpropan, 15N-α-L-lysine oder 15N-ε-L-lysine wurden gemessen bei niedrigem pH-Wert ausschließlich die getrennten Reaktanden und über pH 4 die ein- und zweiköpfigen SB detektiert. Bei hohen pH-Werten wird ein Geminales Diamin mit Diaminopropan gebildet, nicht aber mit L-Lysin. Während die SB mit der α-Aminogruppe bei hohem pH bereits wieder zerfällt, ist die SB mit der ε-Aminogruppe bis pH 12 stabil. Sowohl Molenbrüche als auch pKa-Werte der verschiedenen PLP-Spezies wurden ermittelt. Bis zu 6 verschiedene Protonierungszustände konnten für jede PLP- Spezies identifiziert werden. Alle SB unterliegen einer Protenentautomerie entlang der intramolekularen OHN H-Brückenbindung. Bei etwa pH 7 liegen alle PLP-Hauptspezies in vergleichbaren Mengen vor, was auf ein subtiles Gleichgewicht der Säure-Basen Eigenschaften der funktionellen Gruppen zurückzuführen ist. Trocken und hydratisert lyophilisierte mit 15N-PLP angereicherte Alaninracemase-Proben wurden mit Festphasen-NMR untersucht. Der Abstand zwischen dem Ringstickstoff des PLP und einem der Guanidinium Stickstoffatome von Arg219 innerhalb des aktiven Zentrums wurde auf 3,01 Å geschätzt. Die Verschiebung des NMR-Signals des Pyridinrings in der hydrierten Alaninracemase weist darauf hin, dass die Gleichgewichtskonstante der Tautomerie zwischen der Enolimin und der Iminophenoxid-Form durch Zugabe von Wasser verschoben werden kann. Derselbe Effekt lässt sich in poly-L-Lysin beobachten. Die Modellierung von Eigenschaften und Funktionen des enzymatischen Cofaktors PLP durch NMR zeigt die besondere Wichtigkeit der SB Tautomerie für die Aktivierung der internen SB, welche die Transiminierung auslöst. Transiminierung verläuft eher über eine Mikrosolvatisierung der SB als über den Weg des Geminaldiamins ab. Diese Mikrosolvatisierung führt zur Hydrolyse der PLP SB und damit zur Freisetzung der Aldehydform von PLP, welches direkt mit einer anderen Aminogruppe kondensieren und somit die Transiminierung durchführen kann.