Organization of olfactory signal transduction - a molecular analysis

Abstract

Over 1.000 olfactory receptors and more than 100 vomeronasal receptors translate a tremendous amount of information into electrical signals in sensory neurons. These receptors are part of complex signaling cascades localized in specialized cell compartments. The elements of these cascades are quite well understood, but their spatial arrangement inside the signaling compartments remains elusive. The existence of signaling microdomains in the olfactory systems, so called olfactosomes, has been already proposed in the early 2000‘s. It has been recently demonstrated that MUPP1 recruits members of the signaling cascade from olfactory sensory neurons into a functional complex. In this thesis, we investigated organization of signaling proteins and provide first optical evidence for the formation of signaling microdomains in cilia of olfactory sensory neurons and microvilli of vomeronasal sensory neurons. The investigations comprised three aspects. (1) We identified potential PDZ domain containing sca_olding proteins which could organize the signal transduction cascade in the vomeronasal organ, and identified NHERF1 and DLG1 as potential organizers of vomeronasal signal transduction. NHERF1 and DLG1 were found to be expressed in the vomeronasal organ, localized in microvilli of vomeronasal sensory neurons, and demonstrated to interact with vomeronasal receptors in an in vitro interaction assay. (2) We analyzed the spatial organization of signaling proteins in the main olfactory epithelium and the vomeronasal organ using super-resolution microscopy. We demonstrated that signaling proteins in both neuron types are organized in spatially segregated microdomains. This observation includes Anoctamins, NHERF1 and the G protein G_i2. (3) We investigated direct interaction between Anoctamin proteins to elucidate their function as calcium-gated chloride channels in olfactory signal transduction. Anoctamin 2 was recently identified as the major component of calciumgated chloride conductance in olfactory sensory neurons. Vomeronasal sensory neurons also rely on calcium-gated chloride channels for signal transduction, their identity, however, remains elusive. We identified Anoctamin 1 and Anoctamin 2 expression microvilli of vomeronasal sensory neurons, and demonstrate co-localization with the signaling protein G_i2. We also identified Anoctamin 6 in cilia of olfactory sensory neurons. Anoctamin 6 is also organized in segregated microdomains, co-localizing with Anoctamin 2. Furthermore, we demonstrated direct interaction of Anoctamin 2 with Anoctamin 6 and Anoctamin 1, and this interaction has direct e_ects on the chloride currents mediated by recombinantly expressed Anoctamin proteins. Co-expression of di_erent Anoctamins could therefore have physiological relevance for olfactory signaling.

Über 1.000 olfaktorische Rezeptoren und mehr als 100 vomeronasale Rezeptoren in sensorischen Neuronen übersetzen eine enorme Informationsmenge in elektrische Signale. Diese Rezeptoren sind Teil komplexer Signalkaskaden, welche sich in spezialisierten Zellkompartimenten abspielen. Die einzelnen Elemente dieser Kaskaden sind inzwischen gut untersucht, ihre räumliche Organisation innerhalb der zellulären Signalkompartimente ist jedoch weiterhin unverstanden. Die Existenz von Signalmikrodomänen, sogenannter „Olfaktosome“, wurde bereits zu Beginn der 2000er Jahre vermutet. Kürzlich wurde gezeigt, dass MUPP1 Mitglieder der Signalkaskade in olfaktorischen Neuronen in einem funktionellen Komplex zusammenführt. In dieser Arbeit haben wir die Organisation olfaktorischer Signalproteine analysiert und liefern optische Hinweise, für die Formierung von Signalmikrodomänen in den Zilien olfaktorischer Neurone und den Mikrovilli der vomeronasalen Neurone. Unsere Untersuchung gliederte sich in drei Teilbereiche. (1) Wir haben potentielle Gerüstproteine mit PDZ Domänen identifiziert, die an der vomeronasalen Signaltransduktion beteiligt sein könnten. Dabei haben wir NHERF1 und DLG1 als potentielle Organisatoren der vomeronasalen Signaltransduktion identifiziert. Wir fanden NHERF1 und DLG1 im vomeronasal Organ exprimiert und in den Mikrovilli der vomeronasalen Neurone lokalisiert. Mit Hilfe eines in vitro Assay demonstrierten wir die Interaktion von NHERF1 und DLG1 mit vomeronasalen Rezeptoren. (2) Wir haben die räumliche Organisation der Signalproteine im olfaktorischen Epithel und im vomeronasal Organ mithilfe von super-resolution Mikroskopie analysiert. Wir haben gezeigt, dass in beiden Neuronentypen die Signalproteine in räumlich getrennten Mikrodomänen organisiert sind. (3) Wir haben die direkte funktionelle Interaktion zwischen einzelnen Anoctamin- Proteinen untersucht und deren Rolle als Kalzium aktivierte Chlorid-Kanäle für die olfaktorische Signaltransduktion analysiert. Kürzlich wurde Anoctamin 2 als wichtige Komponente des Kalzium aktivierten Chlorid-Stroms in olfaktorischen Neuronen identifiziert. Vomeronasale Neurone benutzen ebenfalls Kalzium aktivierte Chlorid-Ströme zur Signaltransduktion. Die Identität der beteiligten Proteine ist jedoch unbekannt. Wir haben Anoctamin 1 und Anoctamin 2 in den Mikrovilli der vomeronasalen Neurone identifiziert und zeigen, dass beide mit dem Signalprotein Gi2 kolokalisiert sind. Weiterhin konnten wir Anoctamin 6 in Zilien der olfaktorischen Neurone identifizieren. Dort liegt Anoctamin 6 in Mikrodomänen vor, die ebenfalls Anoctamin 2 enthalten. Außerdem haben wir gezeigt, dass Anoctamin 2 mit Anoctamin 1 und Anoctamin 6 interagiert und, dass diese Interaktion direkten Einfluss auf die Kalzium aktivierten Chlorid-Ströme hat, wenn Anoctamine rekombinant exprimiert werden. Koexpression verschiedener Anoctamine in Signalkompartimenten der olfaktorischen Systeme könnte dementsprechend Auswirkungen auf die olfaktorische Signaltransduktion haben.