Unraveling the nanoscale organization and cellular functions of ARF GTPases

Abstract

Cellular membrane homeostasis relies on the coordinated interplay between organelles and the machinery components that allow efficient material exchange. ADP-ribosylation factor (ARF) GTPases are master regulators of intracellular trafficking. Understanding the cellular functions of the five human ARF paralogues has been challenging due to their high sequence similarity and multiple, possibly redundant functions. This study aims to elucidate the endoge-nous nanoscale organization and cellular functions of Golgi-associated type I (ARF1 and ARF3) and type II ARFs (ARF4 and ARF5). For this purpose, I employed CRISPR-Cas9 gene editing to endogenously tag machinery components, combined with live-cell stimulated emis-sion depletion (STED) super-resolution microscopy to study subcellular dynamics at the na-noscale. In the first part of this study, I show that ARF1, ARF4, and ARF5 localize to segregat-ed nanodomains on the first cis-Golgi cisterna and ER-Golgi intermediate compartments (ER-GICs), where they are found in close proximity to COPI machinery, thereby revealing distinct roles in COPI recruitment to segregated early secretory compartments. While ARF1 localizes to cis-Golgi membranes, ARF4 and ARF5 localize to ERGIC elements closely associated with the cis-Golgi that lack ARF1 (which I named Golgi-associated ERGICs; GA-ERGIC), and on peripheral ERGICs dispersed throughout the cytoplasm. This differential localization suggests the presence of functionally distinct intermediate compartments. Further, ARF1 and ARF3 lo-calize to segregated nanodomains on the trans-Golgi network (TGN) and are found on TGN-derived post-Golgi tubules, suggesting different functions in post-Golgi sorting.

Building upon my observations suggesting functionally distinct ERGICs, I set out to investigate the mechanism of ER-to-Golgi transport, focusing on the role of ARF4 in this process and un-derstanding its dynamic relationship with coat components (COPI and COPII). The central ve-sicular dogma proposes that intracellular traffic is mediated by vesicles that bud from a donor membrane and fuse with an acceptor membrane. COPI and COPII vesicles have been depict-ed in models explaining cargo transport between the endoplasmic reticulum (ER) and the Gol-gi. However, recent studies suggest a new model in which COPII, rather than forming vesicles, stably localizes to the neck of a tubular-vesicular network that would serve as a cargo export site. Although spatially segregated from COPII, this network contains COPI, suggesting that both coat proteins are involved in the organization of tubular transport intermediates mediating ER-to-ERGIC/Golgi transport. Supporting the new model of transport, I demonstrate that se-cretory cargo traffics from the ER towards the Golgi via a tubular-vesicular ARF4-positive ER-GIC network. Dynamic ERGICs are associated with static COPII-marked ER-exit sites (ERES) and ARF4 tubules can form de novo from the same static ERES. Further, ERGICs are deco-rated by COPI nanodomains, which remain stably associated to the translocating tubules and are not enriched with anterograde cargo. STED microscopy and functional trafficking assays reveal that GA-ERGICs serve as an entry gateway to the first Golgi cisternae and are directly connected to ERES. Additionally, acute degradation of endogenous ARF4 causes COPI disso-ciation from membranes and misregulates ER-to-Golgi transport, suggesting that ARF4 (and COPI) have a regulatory role in anterograde ER-to-Golgi transport. Based on these observa-tions, I propose a model in which the ARF4 ERGIC network provides a platform for cargo ex-change via direct continuities between the ER and the ERGIC, while COPI serves the function of capturing and concentrating cargo that needs to be retrieved back to the ER.

Collectively, this study provides the first nanoscale map of Golgi-associated human ARF GTPases on cellular membranes, thereby shedding light on their diverse functions. Further-more, this study provides novel mechanistic insights on the role of ERGICs, ARF4 and COPI in segregating cargo in the early secretory pathway.

Zelluläre Homöostase beruht auf einem koordinierten Zusammenspiel zwischen Zellorganellen und Protein-Transportmaschinerien, die einen effizienten Materialaustausch ermöglichen. ADP-Ribosylierungsfaktor (ARF)-GTPasen sind die Hauptregulatoren des intrazellulären Transports. Bislang war die Untersuchung der fünf humanen ARF-Paralogen aufgrund ihrer hohen Sequenzähnlichkeit und möglicherweise redundanten Funktionen eine Herausforde-rung. Diese Studie zielt darauf ab, die nanoskalige Organisation und zellulären Funktionen der Golgi-assoziierten Typ-I-ARF (ARF1 und ARF3) und Typ-II-ARF (ARF4 und ARF5) zu untersu-chen. Dafür wird CRISPR-Cas9-Gentechnik zur endogenen Markierung von Protein-Transportmaschinerie in Kombination mit Stimulated Emission Depletion (STED) Superauflö-sungsmikroskopie in lebenden Zellen durchgeführt. Dies ermöglicht auch die Analyse von sub-zellulären Dynamiken auf nanoskaliger Ebene. Im ersten Teil dieser Studie zeige ich, dass ARF1, ARF4 und ARF5 sich in segregierten Nanodomänen auf der ersten cis-Golgi-Cisterna und ER-Golgi-Zwischenkompartiment (ERGICs) befinden, wo sie in unmittelbarer Nähe zur COPI-Maschinerie lokalisiert sind, die unterschiedliche Funktionen bei der Rekrutierung von COPI zu segregierten frühen sekretorischen Kompartimenten zeigen. Während ARF1 an der cis-Golgi-Membranen lokalisiert ist, lokalisieren ARF4 und ARF5 an ERGIC-Elementen, die eng mit dem cis-Golgi assoziiert sind und in denen ARF1 fehlt - in der vorliegenden Dissertati-on als Golgi-assoziierte ERGICs, kurz GA-ERGIC, bezeichnet - sowie an peripheren ERGICs, die im gesamten Zytoplasma dispers verteilt sind. Diese abweichenden Lokalisierungen lassen die Existenz funktionell unterschiedlicher Zwischenkompartiments vermuten. Des Weiteren lokalisieren sich ARF1 und ARF3 in segregierten Nanodomänen des trans-Golgi-Netzwerks (TGN) und wurden an TGN-abgeleiteten post-Golgi-Tubuli gefunden, was auf unterschiedliche Funktionen bei der Sortierung am Post-Golgi hinweist.

Aufbauend auf den zuvor genannten Beobachtungen, die auf funktionell unterschiedliche ERGICs hindeuten, untersuchte ich den Mechanismus des ER-zu-Golgi-Transports. Hierbei fokussiere ich mich auf die Rolle von ARF4 in diesem Prozess und dessen dynamischem Ver-hältnis zu den Mantelkomponenten COPI und COPII. Das zentrale vesikuläre Dogma besagt, dass der intrazelluläre Transport durch Vesikel vermittelt wird, die von einer Spendermembran abgeschnürt werden und mit einer Akzeptormembran verschmelzen. COPI- und COPII-Vesikel wurden in Modellen dargestellt, die den Transport von Frachtgut zwischen dem endoplasmati-schen Retikulum (ER) und dem Golgi-Apparat erklären. Allerdings legen neuere Studien ein alternatives Modell nahe, bei dem COPII sich stabil an den Hals eines tubulär-vesikulären Netzwerks lokalisiert, das als Frachtgutexportstelle dienen würde. Obwohl räumlich von COPII getrennt, enthält dieses Netzwerk COPI, was darauf hindeutet, dass beide Mantelproteine an der Organisation tubulärer Transportintermediate beteiligt sind, die den Transport vom ER zum ERGIC/Golgi vermitteln. Im zweiten Teil dieser Studie zeige ich, dass sekretorisches Frachtgut über ein tubulär-vesikuläres ARF4-positives ERGIC-Netzwerk vom ER zum Golgi transportiert wird. Diese Erkenntnis stellt das vesikuläre Paradigma in Frage und unterstützt das aufkom-mende Modell des ER-zu-Golgi-Transports über tubuläre Transportintermediate. Dynamische ERGICs sind mit statischen COPII-markierten ER-Austrittsstellen (ERES) assoziiert und ARF4-Tubuli können de novo von denselben statischen ERES gebildet werden. Weiterhin werden ERGICs von COPI-Nanodomänen dekoriert, die stabil mit den translozierenden Tubuli assozi-iert bleiben und nicht mit anterogradem Frachtgut angereichert sind. STED-Mikroskopie und funktionelle Transport-Assays zeigten, dass GA-ERGICs als Eingangstore für die ersten Golgi-Cisterna dienen und direkt mit ERES verbunden sind. Zusätzlich führte der akute Abbau von endogenem ARF4 zu einer Dissoziation von COPI von den Membranen und einer fehlerhaften Regulation des ER-zu-Golgi-Transports, was darauf hindeutet, dass ARF4 (und COPI) eine regulatorische Rolle beim anterograden ER-zu-Golgi-Transport haben. Darauf basierend ent-wickle ich in dieser Studie ein Modell, in dem das ARF4-ERGIC-Netzwerk eine Plattform für den Frachtwechsel über direkte Kontinuitäten zwischen dem ER und den ERGICs bereitstellt, während COPI dazu dient, Frachtgut zu erfassen und zu konzentrieren, um zum ER zurück-transportiert zu werden.

Insgesamt liefert diese Studie die erste nanoskalige Karte der menschlichen Golgi-assoziierten ARF-GTPasen auf zellulären Membranen und beleuchtet ihre vielfältigen Funktionen. Außer-dem ermöglicht die Arbeit einen neuen mechanistischen Einblick in die Rolle von ERGIC, ARF4 und COPI bei der Segregation von Frachtgut im frühen sekretorischen Transport.