Quantifizierung von Proneuropeptid- und Prohormonfragmenten im Blut und der Cerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit Morbus Alzheimer

Abstract

Zielstellung: Neuropeptide und Peptidhormone üben wichtige Funktionen im Gehirn aus. Ihre Expression ist möglicherweise bei neurodegenerativen Erkrankungen, wie der Alzheimer-Demenz (AD), verändert. Deshalb stellen diese Peptide potenzielle Biomarker für die Diagnose der AD dar, der häufigsten im Alter auftretenden neurodegenerativen Erkrankung. Aufgrund ihrer geringen Stabilität ist die verlässliche Quantifizierung von Neuropeptiden in Körperflüssigkeiten schwierig. Dieses Problem lässt sich durch die Detektion stabiler Vorläuferfragmente dieser Peptide als Ersatzmoleküle umgehen, wie es für Neurotensin, Calcitonin oder Insulin bereits gezeigt wurde. Ein Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Immunoassays zur Detektion stabiler Vorläuferfragmente des Proenkephalin A (PENK A) und des Protachykinin A (PTA) als Ersatzmarker für die Freisetzung von Enkephalinen bzw. Tachykinin A-Peptiden. Weiterhin wurde die Anwendbarkeit der PENK A-, PTA- und Procalcitonin (PCT)-Quantifizierung in humanem Blut und cerebrospinaler Flüssigkeit (CSF) für die AD-Diagnose untersucht. Methoden: Es wurden sensitive Sandwich-Immunoassays, basierend auf der Chemilumineszenz- und Röhrchenbeschichtungstechnik, zur Detektion stabiler PENK A- und PTA-Fragmente in humanem Blut und CSF entwickelt. Die PENK A-, PTA- und PCT- Immunoreaktivität (IR) wurde in Blut/ CSF-Proben von gesunden Kontrollen und Patienten mit primären Demenzerkrankungen, wie der Alzheimer-Demenz, der frontotemporalen Demenz, der Demenz mit Lewy-Bodies und der vaskulären Demenz gemessen. Ergebnisse: Es wurden zwei Immunoassays zur Detektion der PENK A 119-159- und PTA 1-37-IR in Blut und CSF entwickelt. Diese Fragmente konnten in detektierbaren Mengen im Blut und CSF gemessen werden und waren für mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur stabil. Die PENK A 119-159-, PTA 1-37- und PCT-Konzentrationen im Blut von Demenzpatienten unterschieden sich nicht signifikant von denen gesunder Kontrollen. Im Gegensatz dazu waren die PENK A 119-159- und PTA 1-37-IR bei Demenzpatienten signifikant erniedrigt, wohingegen im Vergleich zu den Kontrollen PCT signifikant erhöht war. Jedoch unter-schieden sich die verschiedenen Demenzgruppen differenzialdiagnostisch nicht voneinander. Des Weiteren konnte ein Konzentrationsgradient von 140:1 für PENK A 119-159 und von 72:1 für PTA 1-37 zwischen CSF und Blut gemessen werden. Schlussfolgerung: Die Detektion der PENK A 119-159- und PTA 1-37-IR kann als indirekte Quantifizierungsmethode für Enkephaline und Tachykinin A-Peptide verwendet werden. Die Quantifizierung der PENK A 119-159-, PTA 1-37- and PCT-IR in CSF ist für die Diagnose primärer Demenzen anwendbar, jedoch nicht spezifisch für AD. Weiterhin sind die Konzentrationsgradienten der PENK A 119-159- und PTA 1-37-IR deutlich höher als der CSF-Serum-Quotient des Beta- Trace-Proteins mit 34:1, dem höchsten bisher bekannten Konzentrationsgradienten.

Objective: Neuropeptides and peptide hormones have important functions within the brain. Their expression may be altered in neurodegenerative diseases like Alzheimer´s disease (AD). There-fore, these peptides represent potential biomarkers in the diagnosis of AD, the most abundant type of age-related neurodegenerative disorders. However, a reliable quantification of neuropep- tides and peptide hormones in body fluids is difficult mainly due to their low stability. This problem could be solved by detecting stable precursor fragments as surrogate molecules of these peptides, as it was shown for neurotensin, calcitonin or insulin. The aim of this study was to de-velop immunoassays to detect stable fragments of the precursors proenkephalin A (PENK A) and protachykinin A (PTA) as surrogate markers for the release of enkephalin- and tachykinin A-peptides, respectively. Moreover, the applicability of PENK A, PTA and Procalcitonin (PCT) quantification in human blood and cerebrospinal fluid (CSF) in the diagnosis of AD was invest-tigated. Methods: Sensitive sandwich immunoassays, based on the chemiluminescence and coated-tube technique, were developed for the detection of stable PENK A- and PTA-fragments in human blood and CSF. PENK A-, PTA- and PCT-immunoreactivity (IR) were measured in blood/ CSF samples of healthy controls, patients with primary dementia disorders, including AD, frontotemporal dementia, dementia with Lewy-Bodies and vascular dementia. Results: Two immunoassays to detect PENK A 119-159- and PTA 1-37-IR in blood and CSF were developed. These fragments were measured in detectable amounts in blood and CSF samples and were stable for at least 48 hours at room temperature. PENK A 119-159-, PTA 1-37- and PCT-concen-trations were not significantly different in blood of patients with primary dementia when com-pared to controls. In contrast, PENK A 119-159- and PTA 1-37-IR were significantly decreased, whereas PCT was significantly increased in CSF of dementia patients when compared to con- trols. However, there was no difference between distinct groups of dementia. Moreover, concen-tration gradients of 140:1 and 72:1 between CSF and blood were detected for PENK A 119-159- and PTA 1-37-IR, respectively. Conclusion: The detection of PENK A 119-159- and PTA 1-37-IR can be used as surrogate quantification method for enkephalins and tachykinin A-peptides, respectively. Measurement of PENK A 119-159-, PTA 1-37- and PCT-IR in CSF is applicable in the diagnosis of primary dementia, but not specifically for AD. Moreover, the concentration gradients of both, PENK A 119-159- and PTA 1-37-IR, are much greater compared to the CSF/ serum ratio of 34:1 for beta-trace protein, the highest ratio known so far.