Identification of CLK2 and CLK4 as novel regulators of DNA damage-induced NF-κB activity by chemical dissection

Abstract

Chemotherapy and radiation are standard-of-care cancer treatments, but their effectiveness is often hampered by therapy resistance within the tumor. Numerous studies have demonstrated that tumor cells can evade cell death triggered by genotoxic therapies by activating IKK/NF-κB pathway, thereby preventing apoptosis. The direct targeting of IKKs using pharmacological interventions is not a viable option due to the significant adverse effects caused by the essential role of IKK/NF-κB signaling in various physiological processes. To circumvent this, previous work by our group identified structurally unrelated small molecule inhibitors, MW01 and MW05, that selectively inhibit IKK/NF-κB solely in response to DNA double strand breaks induced by chemotherapy and radiation. Importantly, these compounds do not interfere with IKK/NF-κB activation triggered by other physiological stimuli. Initial work began by confirming the genotoxic stress-specific inhibition by the compounds before moving onto target identification studies. Considering the similar cellular effects of both compounds within the DNA damage-induced NF-κB pathway, comparative target identification studies including kinase assay panels, structural derivatization, and molecular signaling characterization were performed, seeking targets shared between both lead compounds. Common regulators shared by other NF-κB stimuli were first excluded as potential targets of the compounds before investigation of the several identified shared targets revealed a previously unknown regulators of genotoxic stress-induced NF-κB activity, Cdc-like kinases (CLK) 2 and 4, as the functional target of MW01 and MW05. Silencing of the CLK2 and 4 revealed that they are essential for DNA damage-induced NF-κB activity and promote the phosphorylation of IKK at Ser-85, a genotoxic stress specific ATM-dependent phosphosite, critically localizing the CLKs within the cascade between ATM and IKK. CLK2 and 4 were also confirmed as the target of active structural derivatives of MW01 and MW05 and were spared by inactive derivatives, confirming CLK2 and 4’s role in genotoxic stress-induced NF-κB. In addition, CLK inhibitor MU-1210 also inhibited NF-κB following DNA damage, suggesting that CLK inhibitors could be used to potentiate the tumor killing effect of standard cancer treatments. MW01 and MW05 were tested in co-treatment with DNA damaging agents, in the context of on-going DNA damage, and in patient derived glioblastoma cells to assess their potential clinical applications. Critically, neither MW01 nor MW05 exhibit general toxicity; instead, they notably enhance apoptosis specifically in tumor cells following genotoxic stress. In BRCA1-deficient cells and in co-treatment with PARP inhibitor Olaparib, both characterized by on-going DNA damage, MW01 and MW05 potentiated DNA damage and p53 levels, suggesting that the compounds unbalance the NF-κB/p53 axis in favor of apoptosis. This approach introduces a novel therapeutic strategy to curb NF-κB activity induced by DNA damage in cancer cells without impacting its essential functions in healthy cells.

Chemotherapie und Bestrahlung gehören zu den Standard-Krebstherapien, ihre Wirksamkeit wird jedoch häufig durch das Auftreten von Therapieresistenzen im Tumor beeinträchtigt. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Tumorzellen dem durch genotoxische Therapien ausgelösten Zelltod entgehen können, indem sie den IKK/NF-κB-Signalweg aktivieren und so die Apoptose verhindern. Das direkte Angreifen von IKKs durch pharmakologische Interventionen ist keine praktikable Option, da die wesentliche Rolle der IKK/NF-κB-Signalübertragung bei verschiedenen physiologischen Prozessen erhebliche negative Auswirkungen erwarten lässt. Um dies zu umgehen, hat unsere Gruppe strukturell nicht verwandte niedermolekulare Inhibitoren, MW01 und MW05, identifiziert, die die einzigartige Fähigkeit besitzen, die Aktivierung von IKK/NF-κB ausschließlich als Reaktion auf durch Chemotherapie und Bestrahlung verursachte DNA-Doppelstrangbrüche selektiv zu hemmen. Wichtig ist, dass diese Verbindungen die durch andere normale physiologische Reize ausgelöste IKK/NF-κB-Aktivierung nicht beeinträchtigen. Die ersten Arbeiten begannen mit der Bestätigung der genotoxischen Stress-spezifischen Hemmung durch die Verbindungen, bevor die Studien zur Identifizierung der Targets fortgesetzt wurden. In Anbetracht der ähnlichen zellulären Wirkungen beider Verbindungen innerhalb des durch DNA-Schäden induzierten NF-κB-Stoffwechsels wurden vergleichende Studien zur Identifizierung von Zielmolekülen durchgeführt, einschließlich Kinase-Assay-Panels, struktureller Derivatisierung und molekularer Signalcharakterisierung, um gemeinsame Zielmoleküle der beiden Leitverbindungen zu finden. Gemeinsame Regulatoren anderer NF-κB-Stimuli wurden zunächst als potenzielle Ziel-Proteine der Verbindungen ausgeschlossen, bevor die Untersuchung der verschiedenen identifizierten gemeinsamen Ziel-Enzyme einen bisher unbekannten Regulator der durch genotoxischen Stress induzierten NF-κB-Aktivität, die Cdc-ähnlichen Kinasen 2 und 4 (CLK2 und 4), als funktionelles Ziel von MW01 und MW05 ergab. CLK2 und 4 wurden auch als Ziel-Kinasen aktiver Strukturderivate von MW01 und MW05 bestätigt und blieben von inaktiven Derivaten verschont, was die Rolle von CLK2 und 4 bei der durch genotoxischen Stress induzierten NF-κB bestätigt. Darüber hinaus hemmte ein externer, strukturell unähnlicher CLK-Inhibitor, MU-1210, ebenfalls NF- κB nach DNA-Schäden, was darauf hindeutet, dass CLK-Inhibitoren zur Verstärkung der tumortötenden Wirkung von Standard-Krebstherapien eingesetzt werden könnten. Parallel zu den Studien zur Identifizierung der Zielmoleküle wurden MW01 und MW05 auch bei der gleichzeitigen Behandlung mit DNA-schädigenden Substanzen, im Zusammenhang mit laufenden DNA-Schäden und in Glioblastomzellen von Patienten getestet, um ihre potenziellen klinischen Anwendungen zu bewerten. Kritisch anzumerken ist, dass weder MW01 noch MW05 eine allgemeine Toxizität aufweisen; stattdessen verstärken sie insbesondere die Apoptose in Tumorzellen nach genotoxischem Stress. In BRCA1-defizienten Zellen und bei gleichzeitiger Behandlung mit dem PARP-Inhibitor Olaparib, die beide durch anhaltende DNA-Schäden gekennzeichnet sind, verstärkten MW01 und MW05 den γH2AX-Wert, einen Marker für DNA-Schäden, und den p53-Wert, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen die NF-κB/p53-Achse zugunsten der Apoptose aus dem Gleichgewicht bringen. Dieser Ansatz stellt eine neuartige therapeutische Strategie dar, um die durch DNA-Schäden in Krebszellen induzierte NF-κB-Aktivität zu bremsen, ohne ihre wesentlichen Funktionen in gesunden Zellen zu beeinträchtigen.