Expression of VIM, TPI and MAT2A and their impact on in vitro angiogenesis in human dermal microvascular endothelial cells

Abstract

Angiogenesis is the dynamic process of building new blood vessels from pre-existing ones. During sprouting angiogenesis, tip cells are mainly responsible for migration, stalk cells for proliferation and phalanx cells for maturation of the new vessel. Major research effort was directed to anti- and pro-angiogenic therapy. Therefore, in vitro models are frequently used. However, these assays face problems regarding reproducibility based on single stage assays and the inhomogeneous character of endothelial cells (ECs). When establishing and performing the all-in-one assay, which covers all stages of in vitro angiogenesis, differences regarding angiogenic potency was detected resulting in a classification of ECs into angiogenic and non-angiogenic. Proteome expression profiles of both classes exhibited one protein only found in non-angiogenic ECs, i.e. adenosylmethionine synthetase isoform type 2 (MAT2A), and seven proteins exclusively in angiogenic ECs. MAT2A represents a highly conserved enzyme being mainly involved in regulatory functions and suggested to have anti-angiogenic effects. Among the seven proteins found in angiogenic ECs, vimentin (VIM) and triosephosphate isomerase (TPI) are hypothesized to have pro-angiogenic impact on ECs. By VIM being a type III intermediate filament protein, it is highly involved in cell shape and motility. TPI is a glycolic enzyme generating energy and mainly influencing cell proliferation.

Both studies aimed to determine whether the expression of VIM, TPI and MAT2A is related to angiogenesis in vitro in human dermal microvascular endothelial cells (HDMECs). Therefore, two batches of HDMECs were long-term cultivated using pro-angiogenic media. Quantification of in vitro angiogenesis was carried out using phase-contrast microscopy twice a week. Knockdown groups got infected with lentiviral particles initiating a knockdown of VIM or TPI respectively. Additionally, a non-coding sequence was used for the infection of control groups. At days 1, 5, 25 and 50, cells of all groups were harvested and used for mRNA and Protein expression analysis. The mRNA expression of vascular endothelial growth factor 1 (VEGFR-1), vascular endothelial growth factor 2 (VEGFR-2), and mRNA and protein expression of VIM, TPI and MAT2A were determined by RT-qPCR and Western Blot.

In native cells, VIM was shown to be expressed mainly in beginning stages of sprouting and migrating, which are suggested to be enabled by VIM’s influence on the cytoskeleton. By knocking down VIM, cell death and a deceleration of in vitro angiogenesis was observed leading to the conclusion of VIM being an essential protein for HDMECs survival and having pro-angiogenic effects on ECs. For TPI, native cells showed an overall increase in Expression over the cultivation period. By TPI providing energy for cells, it is suggested to be essential for most angiogenic stages, i.e. cell migration, proliferation, and tube formation. By knocking down TPI, a deceleration of in vitro Angiogenesis was observed, leading to the assumption of TPI increasing the angiogenic potency of ECs. Furthermore, native TPI expression was shown to be consistent. The single decrease of TPI expression was connected to cell death, showing the essential character of TPI for HDMECs survival. Native MAT2A expression was highest at the beginning of cultivation, followed by a significant decrease. Moreover, a final increase was detected. With MAT2A owning regulatory functions via methylations, it is suggested to have anti-angiogenic effects, mainly expressed in quiescent cells and involved in maturation of HDMECs. In both knockdown studies, MAT2A displayed an overall tendency of being increased when lowering the angiogenic potency, supporting the assumption of MAT2A impacting anti-angiogenic events. By characterizing both batches of HDMECs via VEGFR-1 and VEGFR-2 expression, it was shown that HD1 comprised a higher amount of stalk cells. The difference in distribution of cell differentiation led to a divergence in angiogenic, compensatory and expressional behaviour of the batches. HD1 inherited a higher proliferative power which was visible in them having a higher cell density and higher values of sums of assigned stages. With HD1 owning more stalk cells, VIM expression was lower and TPI was significantly higher in contrast to HD2. Furthermore, HD2 displayed an acceleration of in vitro angiogenesis, which was connected to higher MAT2A Ct-values. Additionally, knockdown cells of HD1 were able to recover from infection by increasing their cell density and progressing to further angiogenic stages, while knockdown cells of HD2 were either stagnating their differentiation or displaying cell death. Further, control group of HD2 displayed a deceleration of in vitro angiogenesis while control group of HD1 was unaffected. Overall, it has been shown that the characterization of cell differentiations is of immense importance for EC application and the interpretation of in vitro angiogenesis assays.

Experiments should get repeated including cells from different distributors involving nonangiogenic cells, cell characterization should be extended by an additional detection method and specific assays should get employed for validating protein effects. For comprehension to living systems, subsequent experiments should involve more than one cell type, followed by in vivo studies. MAT2A knockdown should be initiated and further proteins influencing the angiogenic potency should be examined. Furthermore, upcoming investigations should Focus on developing and optimizing the characterization of EC populations to increase reproducibility and reliability of studies in the field of in vitro angiogenesis.

Als Angiogenese wird der dynamische Prozess bezeichnet, der zur Neubildung von Blutgefäßen aus bereits existierenden führt. Die sprossende Angiogenese vollzieht sich durch die Migration der Tip cells, die Proliferation von Stalk cells und die Maturation von Phalanx cells. In Rahmen der Angiogenese-Forschung kommen In-vitro-Modelle regelmäßig zum Einsatz. Sie haben jedoch häufig Probleme bezüglich ihrer Reproduzierbarkeit. Mit der Entwicklung und dem Einsatz eines all-in-one assays, wurden Unterschiede bezüglich der angiogenen Potenz von Endothelzellen (ECs) festgestellt, die eine Klassifizierung in angiogene und nicht-angiogene ECs zur Folge hatten. Eine Proteomanalyse beider Gruppen zeigte, dass das Protein Adenosylmethionine-Synthetase Isoform Typ 2 (MAT2A) ausschließlich in nicht-angiogenen ECs exprimiert wurde. Dieses Enzym weist vor allem regulatorische Funktionen auf und hat vermutlich einen anti-angiogenen Effekt auf ECs. Die Proteine Vimentin (VIM) und Triosphosphate Isomerase (TPI) wurden nur in angiogenen ECs gefunden. Deshalb wurde vermutet, dass sie pro-angiogene Effekte auf ECs haben. VIM ist ein Typ III Intermediärfilament und beeinflusst Zellform und -motilität. TPI ist ein glykolytisches Enzym, welches Energie generiert und besonders die zelluläre Proliferation beeinflussen kann.

Das Ziel beider Studien bestand darin, zu ermitteln, ob eine Verbindung zwischen der Expression von VIM, TPI und MAT2A und der In-vitro-Angiogenese in humanen dermalen mikrovaskularen ECs (HDMECs) besteht. Dafür wurden zwei Chargen an HDMECs unter Verwendung eines pro-angiogenen Mediums langzeit-kultiviert. Die Quantifizierung der In-vitro-Angiogenese erfolgte anhand phasenkontrastmikroskopischer Aufnahmen. Der Knockdown von VIM oder TPI wurde mittels lentiviralen Partikeln initiiert. Die mRNAExpression von Vascular endothelial growth factor 1 (VEGFR-1) und Vascular endothelial growth factor 2 (VEGFR-2) und die mRNA- und Proteinexpression von VIM, TPI und MAT2A mittels RT-qPCR und Western Blot wurde an Tag 1, 5, 15, 25 und 50 analysiert.

In nativen Zellen zeigte sich die stärkste VIM-Expression hauptsächlich in den Stadien der Sprossung und Migration, die vermutlich durch VIM und dessen Einfluss auf das Zytoskelett angetrieben wurden. Während des Knockdowns von VIM, wurde ein starker Zelltod in Knockdown-Kulturen und eine Verzögerung der In-vitro-Angiogenese ermittelt. Dies führt zu der Vermutung, dass es sich bei VIM um ein für die Angiogenese essenzielles Protein handelt, das die angiogene Potenz steigert. Für TPI konnte in nativen Zellen ein allgemeiner Anstieg der Expression im Laufe der Kultivierung gezeigt werden. Da durch TPI den Zellen Energie zur Verfügung gestellt wird, ist es nachvollziehbar, dass TPI im Prozess der In-vitro-Angiogenese notwendig für die Stadien der Migration, Proliferation und Lumenbildung ist. Der TPI-Knockdown führte zu einer Verzögerung der In-vitro-Angiogenese, was vermuten lässt, dass TPI die angiogene Potenz vom ECs erhöht. Die konstante Expression vom TPI und der mit dem Abfall der TPI-Expression assoziiert Zelltod, lässt auf den essenziellen Charakter von TPI für das Überleben der Zellen schließen. Die native MAT2A-Expression war zu Beginn und am Ende der In-vitro-Angiogenese am stärksten. MAT2A besitzt vorwiegend regulierende Funktionen durch Methylierungen und ist dadurch vermutlich ein Protein, das besonders in ruhenden ECs exprimiert wird und an deren Maturation beteiligt ist. Beide Studien zeigten die Tendenz einer verringerten MAT2A-Expression in Verbindung mit einer geringeren angiogenen Potenz, welches die Vermutung unterstützt, dass MAT2A vornehmlich anti-angiogene Effekte auf HDMECs hat. Zusätzlich wurden beide Chargen anhand ihrer VEGFR-1 und VEGFR-2 Expression charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass HD1 eine höhere Anzahl an Stalk cells besaß, wodurch angenommen wird, dass HD1 eine höhere proliferative Kraft besitzt, welche zu einer höheren Zelldichte und zu höheren Werten bei der Quantifizierung der In-vitro-Angiogenese führte. Dies könnte auch der Grund dafür sein, dass in HD1 die VIM-Expression geringer und die TPI-Expression höher war als bei HD2. Darüber hinaus konnte in HD2 eine Beschleunigung der In-vitro-Angiogenese beobachtet werden, welche mit höheren MAT2A-Ct-Werten einherging. Des Weiteren zeigten Knockdown-Zellen von HD1 eine Erhöhung der Zelldichte und das Voranschreiten in höhere Stadien, wohingegen Knockdown-Zellen von HD2 entweder in einem frühen Stadium stagnierten oder zugrunde gingen. Zudem zeigte selbst die Kontrollgruppen von HD2 eine Verzögerung der In-vitro-Angiogenese, während die Kontrollgruppen von HD1 unbeeinflusst waren. Insgesamt wird deutlich, dass es für den Einsatz von ECs in In-vitro-Studien und die Interpretation von Forschungsergebnissen zwingend notwendig ist, Zellkulturen zu charakterisieren.

Es ist angeraten, die Experimente unter Verwendung von Zellen unterschiedlicher Hersteller und unter Einsatz von nicht-angiogenen ECs zu wiederholen, eine weitere Nachweismethode zur Zellcharakterisierung hinzuzuziehen und eine Validierung der Proteineffekte mittels spezifischer Assays durchzuführen. Um die Ergebnisse auf das lebende System zu transferieren, sind Versuche notwendig, die mehr als eine Zellart aufweisen, gefolgt von In-vivo-Studien. Es ist angeraten einen MAT2A-Knockdown zu initiieren und weitere Proteine zu untersuchen, die potenziellen pro- oder anti-angiogenen Einfluss auf ECs haben. Des Weiteren sollten zukünftige Projekte auf die Entwicklung und Optimierung der Zellcharakterisierung abzielen, um die Reproduzierbarkeit und die Zuverlässigkeit von Studien im Bereich der In-vitro-Angiogenese zu verbessern.