Vorkommen regulatorischer Zellen abhängig vom Sentinelnode-Befall beim Malignen Melanom

Abstract

Hintergrund: Das Maligne Melanom ist eine sehr immunogene Tumorentität, die im fortgeschrittenen Stadium mit einer sehr schlechten Prognose einhergeht. Diese ist von der Eindringtiefe nach Breslow zum Zeitpunkt der Erstdiagnose abhängig. Der Wächterlymphknoten stellt jedoch den bedeutendsten Prognoseparameter für das krankheitsfreie Intervall und krankheitsspezifisches Überleben dar. Es wurde in vielen Studien gezeigt, dass regulatorische T-Zellen in Tumoren vorkommen und deren erhöhte Anzahl bzw. Frequenz im Blut und Tumorgewebe mit einer schlechteren Prognose des Betroffenen korreliert. Studien beim Melanom zu Tregs untersuchten bislang nicht den Zusammenhang zum klinischen Verlauf und schlossen meist Melanompatienten erst ab Stadium III (Befall des Wächterlymphknotens) ein. Ziel dieser Dissertation war es, Vorkommen und prognostische Bedeutung von regulatorischen T-Zellen unter Einbeziehung des Wächterlymphknotenbefalls beim Melanom zu untersuchen, sowie die Rolle von regulatorischen Monozyten. Material und Methoden: Insgesamt wurden 79 Patienten eingeschlossen, hiervon 1 unbekanntes Stadium (SLN-), 29 Stadium I, 15 Stadium II, 14 Stadium III und 20 Stadium IV (nach AJCC 2009). Die Analyse von Lymphknotenmaterial erfolgte anhand von archiviertem Material. Den Melanompatienten wurde nach Erstdiagnose und vor geplanter SLNB Blut für die Immunanalyse entnommen. Regulatorische T-Zellen wurden durchflusszytometrisch mit 2 unterschiedlichen Färbepanels charakterisiert, ebendfalls regulatorische Monozyten des Subtyps CD14+HLA-DRlow. Die PCR- Analyse auf FoxP3-DNA erfolgte in PBMC und Lymphknoten. Hierfür wurden 12 Patientinnen ohne Befall des Wächterlymphknotens (SLN-, n12) und 7 Patientinnen mit Befall von 1-5 Wächterlymphknoten untersucht (SLN+, n11). Ergebnisse: Die PCR-Analyse von PBMC zeigte eine Tendenz, dass die Patienten mit Befall des Wächterlymphknotens (SLN+) mehr FoxP3-DNA-Expression aufwiesen als die Wächterlymphknoten-negativen-Melanompatienten (SLN-). Nur für die männlichen Proben zeigte sich eine statistische Signifikanz (p = 0,049). Bei den durchflusszytometrischen Analysen hatten Patienten in den frühen Stadien I-II und Gesunde mehr Tregs als Patienten mit fortgeschrittenen Melanomstadien III-IV. Jedoch hatten Melanompatienten statistisch signifikant weniger Treg- Effektorzellen als die Gesunden und eine erhöhte Zahl an Treg-Memory-Zellen (p = 0,02). Es fand sich keine Korrelation zwischen der Anzahl der regulatorischen T-Zellen und dem klinischen Verlauf der Melanompatienten bezüglich des Rezidivrisikos und der Langzeitprognose. Auch die Tumorlast des Wächterlymphknotens und die FoxP3-DNA-Expression korrelierte nicht mit den klinischen Parametern. Für die Monozytenanalysen ließ sich für Melanompatienten im Vergleich zu Gesunden eine statistisch signifikant erhöhte Anzahl des Monozytensubtypes (CD14+HLA-DRlow) nachweisen (p = 0,005). Schlussfolgerung: Die Messung von regulatorischen T-Zellen und regulatorischen Monozyten mittels Durchflusszytometrie sowie PCR im Blut und von Lymphknotengewebe von Melanompatienten kann anhand der vorliegenden Daten nicht als prognostischer Parameter verwendet werden. Spezifische Marker in der primären Diagnostik müssen zur Verbesserung der Klassifizierung der Betroffenen und Optimierung der Therapie gefunden werden.

Background: In melanoma patients the distinction between good and poor prognosis is dependent of the involvement of the Sentinellymphnode (SLN). A new biomarker would increase the accurateness of staging in these patients. Regulatory T cells (Tregs) play a pivotal role in inhibiting of antitumor response. The transcription factor FoxP3 has been reported to play a key role in Treg function. The frequency in circulation and tumor environment is increased in patients with various cancers and correlated with poor prognosis. In this study material of melanoma patients was analyzed to characterize Tregs and regulatory monocytes as a possible diagnostic marker for a better staging. Methods: Peripheral blood monocytes (PBMC) were obtained from healthy donors (n11) and melanoma patients stage I-IV (AJCC 2009, n79). Tregs were identified by FACS and PCR (demethylated FoxP3-DNA). Furthermore FACSanalysis discriminated a subset of monocytes and differentiated Tregs in memory and effector Tcells. A special PCRassay was performed on sentinellymphnodes from melanoma patients (SLN negative n12 and SLN positive n11). Results: The frequency of Tregs was not significantly higher in PBMC from melanoma patients by FACS. The PCRanalysis of PBMC from male donors showed a significant increase in Tregs in SLN positive patients compared to SLN negative (p=0,049). There was no increase in Treg frequency in melanoma involved SLN as expected and no correlation between the clinical outcome of melanoma patients. For regulatory monocytes the analysis by FACS detected a higher frequency in melanoma patients compared to healthy donors. Conclusion: The relevance of Tregs influencing disease outcome of melanoma patients is still controversial.