Konditionale Inaktivierung des Gna13 Gens mit Hilfe des Cree/Locksp Rekombinationssystems

Abstract

Da bisher nur wenige funktionelle Daten über die physiologische Bedeutung von Ga12 und Ga13 bekannt waren, sollte über die Generierung eines konditionalen Gna13 ?Knock-outs? dieses umfangreiche Gebiet näher untersucht werden. Durch Kreuzung des konditionalen Gna13 ?Knock-outs? mit unterschiedlichen Cre-Linien wird eine zeitlich exakt determinierte und gewebespezifische Inaktivierung des Gna13 Gens ermöglicht. Durch die Nutzung des Cre/loxP Rekombinationssystems ist es gelungen, einen konditionalen Gna13 ?Knock-out? herzustellen. Die durch einen ?general-deleter? hervorgerufene Cre-mediierte Rekombination in Gna13flox/- Tieren führt tatsächlich zu der Generierung eines Null-Alleles und damit zu einem dem klassischen Gna13 ?Knock-out? entsprechenden Phänotyp. Dies konnte durch Verpaarungen von Gna13TA/- Mäusen mit EIIaCre/+ Tieren gezeigt werden. Um neben der physiologischen Bedeutung von Ga13, auch die Rolle von Ga12 untersuchen zu können, wurden sämtliche Cre-Linien sowohl in Gna13flox/flox als auch in Gna12-/-; Gna13flox/flox Mäuse eingekreuzt, um auf diesem Wege eine konditionale Inaktivierung der G-Proteine Ga12 und Ga13 zu ermöglichen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Cre-Linien in die o.g. Mauslinien eingekreuzt. Mithilfe der tie-1 Cre Maus, einer Endothelzell- spezifischen Cre-Linie, sollte die Frage beantwortet werden, ob für den zum intrauterinen Tod führenden angiogenetischen Defekt in Gna13 ?Knock-out? Tieren das Fehlen von Ga13 in Endothelzellen oder den umliegenden mesenchymalen Geweben verantwortlich ist. Da aber bisher keine für Analysen ausreichenden Mengen an Endothelzellen isoliert werden konnten, kann diese Frage bisher nicht beantwortet werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass das Fehlen von Ga13 in Endothelzellen nicht zu einer verminderten Leberregeneration in Gna13flox/-;tie-1 Cre Tieren nach partieller Hepatektomie führt. Ein ähnlicher Befund wurde in Gna13flox/-;Mx1-Cre Tieren beobachtet. Auch in diesen Tieren konnte nach einer partiellen Hepatektomie keine reduzierte Leberregeneration beobachtet werden. Offensichtlich scheint weder der Verlust von Ga13 in Endothelzellen noch in Hepatozyten in den untersuchten Modellsystemen von physiologischer Relevanz zu sein. Um die Bedeutung von Ga12 und Ga13 für die Induktion einer hypertrophen Antwort im Herz zu untersuchen, wurde eine Kardiomyozyten-spezifische Mauslinie, Mlc2aCre/+, (Chen et al., persönliche Mitteilung) in Gna13flox/flox bzw. Gna12-/-;Gna13flox/flox Tiere eingekreuzt. Durch b-Galactosidase-Färbungen bzw. Westernblotanalysen konnte gezeigt werden, dass in Kardiomyozyten ein vollständiges Rekombinationsereignis stattfindet. Da aber kein spezifisches Rekombinationsereignis vorliegt, sondern auch in verschiedenen anderen Organen eine Rekombination nachgewiesen wurde, kann die deutlich reduzierte Überlebensrate der Gna13flox/flox;Mlc2aCre/+ bzw. Gna12-/-;Gna13flox/flox;Mlc2aCre/+ neben Herz-spezifischen Defekten, auch auf der unspezifischen Rekombination beruhen. Um die Involvierung von Ga12 und Ga13 in die Hypertrophie-Reaktion zu klären, werden zur Zeit ?Aorten-banding? Operationen an den entsprechenden überlebenden Mäusen durchgeführt. Interessante Daten wurden mithilfe der durch PI-PC induzierbaren Mx1-Cre Mauslinie erhalten. Da neben der Leber auch in der Milz hohe Rekombinationsraten nach i.p. Gabe von PI-PC über Westernblotanalysen gezeigt werden konnten, wurden immunologische Analysen an verschiedenen immunologischen Organen durchgeführt. Neben einer Reduktion der T-Helfer Zellen in der Milz in Gna13flox/flox;Mx1-Cre Mäusen, die durch einen Migrationsdefekt aufgrund des Fehlens von Ga13 hervorgerufen sein könnte, wurde zusätzlich ein B-Zell-spezifischer Defekt beobachtet. In Gna13flox/flox,Mx1-Cre Tieren konnte eine deutliche Reduktion der B-Zellen in der Randzone der Milz gezeigt werden. In lymphozytären Systemen wird eine Signaltransduktionskaskade bestehend aus Ga12/Ga13, dem Rho-GEF Lsc und Pyk-2 beschritten, über die zytoskelettäre Prozesse reguliert werden. Als mögliche Ga12 und Ga13 aktivierende und damit diesen Signalweg regulierende Rezeptoren, kommen solche der Edg-Familie oder G2A in Betracht. An Thrombozytenstudien aus Gna13flox/flox,Mx1-Cre- bzw. Gna13flox/flox;Gna12-/-;Mx1-Cre-Mäusen konnte eindeutig gezeigt werden, dass G13, nicht aber G12 in die Induktion des Thrombozyten ?shape-changes? bei niedrigen Agonisten Konzentrationenen, mit Ausnahme von ADP, involviert ist. Bei höheren Agonist-Konzentrationen wird die Auslösung der ?shape-change? Reaktion von Gq übernommen. Neben der Induktion des ?shape-changes? scheint G13 ebenfalls für aggregatorische Prozesse verantwortlich zu sein. So kommt es nach Gabe verschiedener Stimuli und Ausschaltung ADP-vermittelter Verstärkungsmechanismen, in Gna13flox/flox,Mx1-Cre- bzw. Gna13flox/flox;Gna12-/-;Mx1-Cre-Thrombozyten nicht mehr zu einem vollständigen Aggregationsereignis. Erste Daten deuten auf eine verminderte Aktivierung des aIIbb3 Fibrinogenrezeptors sowie auf eine reduzierte Degranulation hin. Beide Prozesse sind notwendig, um zu einer vollständigen Aggregation zu führen.

Using the Cre/loxP recombination system, we generated a conditional Gna13 knock-out to determine the physiological role of Ga13 in the mouse. Mating of the conditional Gna13 knock-out with a general deleter strain, called EIIa-Cre was indeed leading to the generation of a null-allel, representing the phenotype of the classical Gna13 knock-out. To also determine the role of Ga12 during signal transduction, all Cre-lines were crossed into Gna13flox/flox and Gna12-/-/Gna13flox/flox mice, leading finally to a konditional inactivation of Ga12 and Ga13 in the mouse. Using the tie-1 Cre-line, an endothelial-cell- specific Cre-line, we tried to answer the question, if the observed intrauterine death due to an angiogenetic defect in classical Gna13 knock-out mice is mediated due to the loss of Ga13 in endothelial cells or the loss of Ga13 in surrounding tissues. Since we were not able to isolate an sufficient amount of endothelial cells from mouse aorta, we could not answer this question so far. Anyhow we could show, that the loss of Ga13 in endothelial- cells is not leading to a reduced liver regeneration after partial hepatectomy. Similar results were obtained using Gna13flox/-;Mx1-Cre mice for experiments. To analyse if Ga12 and Ga13 are involved in the induction of a hypertrophic response in the heart, we crossed a cardiomyocyte-specific Cre- line (Mlc2a-Cre) in Gna13flox/flox and Gna12-/-/Gna13flox/flox mice. b-galoctosidase staining and westernblot analysis showed a complete recombination event in cardiomyocytes. Since the recombination event is also taking place in other tissues then cardiomyocytes, a reduced survival rate of Mlc2a-Cre,Gna13flox/flox and Mlc2a-Cre,Gna12-/-/Gna13flox/flox mice, might be due to a deletion of Gna13 in other organs. Interesting data were obtained using the PI-PC inducible Mx1-Cre mouse-line. Recombination and therefore deletion of Gna13 takes place mainly in liver, spleen and the hematopoetic system. Via immunological analysis we found a strong reduction of T-helper cells and a B-cell-specific defect in the spleen of Mx1-Cre,Gna13flox/flox mice. Finally, analyzing platelets of Mx1-Cre,Gna13flox/flox and Mx1-Cre,Gna12-/-/Gna13flox/flox mice, we could show, that Ga13 but not Ga12 is involved in the induction of platelet shape change at low concentrations of agonists. At higher agonist concentrations the induction of platelet shape- change is induced via Gq. Beside its involvement in platelet shape change, Ga13 also plays a critical role in aggregatory responses. Using a variety of different agonists and after ablation of Gi-mediated pathways Mx1-Cre,Gna13flox/flox and Mx1-Cre,Gna12-/-/Gna13flox/flox mice do not show a complete and irreversible aggregation response, mainly due to a reduced activation of the fibrinogen receptor aIIbb3 and reduced degranulation events.