Connecting Endothelial Behavior and Hemodynamics – Method Development for Preclinical Optical Imaging of the Vasculature

Abstract

To fulfill its function of supplying the body with oxygen and nutrients, the healthy vasculature adopts a highly hierarchical network structure. Endothelial cells (ECs), which line the inner walls of blood vessels, are the primary drivers of vascular network patterning. They seem to sense the forces of the blood, i.e. hemodynamics, and respond dynamically to blood flow or oxygenation. Although this dynamic behavior is disrupted in many vascular diseases, many questions remain about the pathways and sensing mechanisms involved. High-resolution microscopy is an excellent tool for deciphering these processes. However, novel imaging and image analysis methods are needed to extract valuable quantitative information about the connection between hemodynamics and endothelial dynamics. In this thesis, I seek to fill this gap by developing quantitative methods to study two well-established in vivo model systems of vascular remodeling, the zebrafish and the developing mouse retina. In my first project, I established an optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) system based on a planar Fabry-Pérot ultrasound sensor for quantitative imaging of hemodynamics in zebrafish. OR-PAM is particularly well suited for imaging the vasculature due to its intrinsic hemoglobin contrast. I show that the developed OR-PAM system meets the requirements for functional imaging of blood flow and oxygenation in the zebrafish trunk vasculature. It features high spatial resolution below 10 μm, backward-mode operation, high acoustic sensitivity, broadband ultrasound detection, a fast image acquisition mode to resolve blood flow, and dual-wavelength excitation to enable spectroscopic imaging of blood oxygenation. Importantly, the OR-PAM system developed in this work can be integrated with other microscopy techniques for simultaneous observation of hemodynamics and endothelial dynamics. I demonstrate its imaging capabilities in leaf skeleton and blood vessel phantoms as well as in vivo in zebrafish. In a second project, I developed a computational image analysis method to extract information about endothelial dynamics from static images of the developing mouse retina based on a lineage tracing approach. By labeling a subset of ECs at a given time point and analyzing the spatial distribution of ECs with respect to a vascular reference system at several later time points, I was able to infer endothelial dynamics. The method shows a shift of ECs from veins to arteries and towards the retinal periphery over time, suggesting directed EC migration. I was also able to quantify migration defects caused by knockout of Cdc42 and Rac1, and showed that Cdc42 is essential for EC migration against flow. Taken together, my transdisciplinary work comprises a significant contribution to the toolbox of methods to study the mechanisms of endothelial dynamics with the goal of identifying the pathomechanisms of vascular disease and developing targeted treatment strategies.

Ein gesundes Gefäßsystem weist eine hochgradig hierarchische Struktur auf, um den Körper mit Sauerstoff und Nährstoffen zu versorgen. Endothelzellen (ECs), die die Innenwände von Blutgefäßen auskleiden, sind die treibende Kraft hinter dieser Strukturierung. Sie scheinen die Kräfte des Blutes, d.h. die Hämodynamik, wahrzunehmen und reagieren dynamisch auf z.B. den Blutfluss und den Sauerstoffgehalt. Obwohl dieses dynamische Verhalten bei vielen Gefäßerkrankungen gestört ist, sind noch viele Fragen über die beteiligten Signalwege und Mechanismen offen. Hochauflösende Mikroskopie ist ein hervorragendes Instrument, um diese Prozesse zu entschlüsseln. Es sind jedoch neue Bildgebungs- und Bildanalysemethoden erforderlich, um quantitative Informationen über die Verbindung zwischen Hämodynamik und Endotheldynamik zu erhalten. In dieser Arbeit habe ich quantitative Methoden entwickelt, um dies in zwei in vivo Modellsystemen für das vaskuläre Remodelling zu erreichen. In meinem ersten Projekt habe ich ein optisch-auflösendes photoakustisches Mikroskop (OR-PAM) basierend auf einem planaren Fabry-Pérot-Ultraschallsensor entwickelt, um die Hämodynamik in Zebrafischen darzustellen. Ich zeige, dass das OR-PAM-System die Anforderungen der funktionellen Bildgebung des Blutflusses und der Sauerstoffsättigung im Rumpfgefäßsystem des Zebrafisches erfüllt. Es bietet eine hohe räumliche Auflösung von weniger als 10 μm, hohe akustische Empfindlichkeit, Breitband-Ultraschalldetektion, einen schnellen Bildaufnahmemodus zur Auflösung des Blutflusses und eine Zwei- Wellenlängen-Anregung für die spektroskopische Darstellung der Blutsauerstoffsättigung. Darüber hinaus kann das entwickelte OR-PAM-System mit anderen Mikroskopietechniken kombiniert werden, um gleichzeitig die Hämodynamik und die Endotheldynamik zu beobachten. Ich demonstriere die Bildgebung in Blattskelett- und Blutgefäßphantomen sowie in vivo im Zebrafisch. In einem zweiten Projekt habe ich eine computergestützte Bildanalysemethode entwickelt, um Informationen über die Endotheldynamik aus statischen Bildern der Mausretina zu extrahieren. Durch die Markierung einer Subpopulation von ECs zu einem bestimmten Zeitpunkt und die Analyse der räumlichen Verteilung der ECs relativ zu einem vaskulären Referenzsystem zu späteren Zeitpunkten konnte ich Rückschlüsse auf die Endotheldynamik ziehen. Die Methode zeigt, dass sich die ECs im Laufe der Zeit von Venen zu Arterien und in die retinale Peripherie bewegen, was auf eine gerichtete Migration der ECs hindeutet. Ich war auch in der Lage, Migrationsdefekte zu quantifizieren, die durch das Ausschalten von Cdc42 und Rac1 verursacht wurden, und konnte zeigen, dass Cdc42 für die EC-Migration gegen den Blutfluss essentiell ist. Insgesamt stellt meine Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Methodenspektrum zur Untersuchung der Mechanismen der Endotheldynamik dar, mit dem Ziel Pathomechanismen von Gefäßerkrankungen zu identifizieren und gezielte Behandlungsstrategien zu entwickeln.