Identification of Ribavirin-Induced Mutations in Patient-Derived Hepatitis E Virus

Abstract

The Hepatitis E Virus (HEV) is an emerging yet underdiagnosed pathogen that is increasingly diagnosed in high-income countries. HEV infection has a predominantly subclinical manifestation; however, HEV genotype 3 can chronify in immunocompromised individuals. Currently, there is no approved antiviral therapy for HEV infection and chronic hepatitis E in particular. Nevertheless, ribavirin has been established as a treatment option for individuals with chronic HEV infection. Mutations in the RNA-dependent RNA-polymerase region (RdRp) associated with therapy failure as well as insertions in the hypervariable region (HVR) are increasingly detected in individuals with chronic HEV infection. Accordingly, for a more detailed characterization of the viral population, new approaches were developed that allowed both full-length and targeted sequencing of HEV-3 genomic regions using novel technologies such as next-generation and third-generation sequencing. Due to the full-length amplification using one pair of primers combined with single-molecule sequencing, haplotyping was facilitated, leading to the first-time detection of an HEVvariant containing two insertions simultaneously. In addition, targeted ultra-deep sequencing has demonstrated utility in the clinical setting by elucidating the effects of standard or novel antiviral treatment options on the occurrence of mutations in the RdRp. The targeted sequencing approach for the HVR facilitated the detection of multiple variants containing different insertions in the same sample and showed that insertions in the HEV genome may occur more frequently than previously assumed. Nevertheless, this work contributes critically to HEV research by means of providing new sequencing methods for HEV and demonstrating utility for assessing therapeutic outcomes in patients with chronic HEV infections. This molecular approach is anticipated to expand our current knowledge of the HEV genome and pathogenesis in chronic hepatitis E.

Das Hepatitis-E-Virus (HEV) ist ein neu aufkommender aber unterdiagnostizierter Erreger, der in Ländern mit hohem Einkommen zunehmend diagnostiziert wird. Die HEV-Infektion verläuft überwiegend subklinisch, wobei der HEV-Genotyp 3 bei immungeschwächten Personen zu einer Chronifizierung führen kann. Derzeit gibt es keine zugelassene antivirale Therapie für HEV-Infektionen und insbesondere der chronischen Hepatitis E; Ribavirin hat sich jedoch als Behandlungsoption für Personen mit chronischer HEV-Infektion etabliert. Mutationen in der RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Region (RdRp), die mit Therapieversagen assoziiert sind, sowie Insertionen in der hypervariablen Region (HVR) werden zunehmend bei Personen mit chronischer HEV-Infektion nachgewiesen. Dementsprechend wurden für eine detailliertere Charakterisierung der Viruspopulation neue Ansätze entwickelt, die sowohl das komplette Genom als auch die gezielte Sequenzierung von HEV-3-Genomregionen mit Hilfe moderner Technologien wie Next- Generation- und Third-Generation-Sequencing ermöglichen. Durch die Amplifikation des kompletten Genoms mit einem Primerpaar in Kombination mit der Single-Molecule-Sequencing wurde die Haplotypisierung ermöglicht, was zum ersten Nachweis einer HEVVariante führte, die zwei Insertionen gleichzeitig enthält. Darüber hinaus hat die gezielte ultra-tiefe Sequenzierung ihren Nutzen im klinischen Umfeld bewiesen, indem sie die Auswirkungen von Standard- oder neuen antiviralen Behandlungsoptionen auf das Auftreten von Mutationen im RdRp aufklärt. Der gezielte Sequenzierungsansatz für das HVR erleichterte den Nachweis mehrerer Varianten mit unterschiedlichen Insertionen in derselben Probe und zeigte, dass Insertionen im HEV-Genom häufiger auftreten können als bisher angenommen. Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zur HEV-Forschung, indem sie neue Sequenzierungsmethoden für HEV beschreibt und deren Nutzen für die Beurteilung des therapeutischen Erfolgs bei Patienten mit chronischen HEV-Infektionen aufzeigt. Es ist zu erwarten, dass dieser molekulare Ansatz unser derzeitiges Wissen über das HEV-Genom und die Pathogenese der chronischen Hepatitis E erweitern wird.