Testing specificity and efficacy of T cell receptors derived from in vitro generated T cells stimulated with STAT3-mutated peptide

Abstract

Background: In contrast to chimeric antigen receptor (CAR) based therapy, T cell receptor (TCR) based adoptive T cell therapy relies on classical TCR recognition of processed epitopes presented in the context of MHC molecules, rather than on antibody recognition. This greatly widens the spectrum of targetable antigens, including truly cancer-specific mutant antigens, the so-called “neoantigens”. Therefore, the gene signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is the ideal target, as it has a highly oncogenic potential when mutated. Constitutive activating mutations in STAT3, like D661Y, occur predominantly in difficult-to-treat T cell lymphoma. Here, we aim to generate a high-affinity TCR to specifically target HLA-A*02:01 restricted potential neoepitope IIMGYKIMYA encompassing the STAT3 D661Y mutation. Methods: Based on isolated RNA derived from reactive T cells primed in vitro with STAT3 D661Y peptide, the most frequent variable TCR sequences were identified and cloned together with constant regions in a retroviral vector backbone for transduction into PBMCs. The generated T cell clones were used for functional T cell assays with the Hodgkin lymphoma-derived cell line HDLM-2 and K562 cells transduced with HLA-A*02:01 and a STAT3 D661Y minigene. Target peptide expression was controlled via mass spectrometry analysis for K562-A2-STAT3-D661Y minigene cells. Results: Eight TCRs were identified and tested. Peptide titration experiments showed robust TCR T cell activation of four TCRs with high functional avidity against the 10mer peptide IIMGYKIMYA (EC50 in nM range). In the subsequent cocultures with STAT3 redirected TCR T cells and K562-A2-STAT3-D661Y minigene transduced cells, high IFN- secretion was detected. Surprisingly, robust CD137 upregulation and IFN- secretion in coculture with HDLM-2 was not observed, although it was proven that HDLM-2 cells are indeed heterozygous for the STAT3 D661Y mutation and possess an intact processing and loading machinery. Tandem mass spectrometry analysis revealed an absent target epitope on HDLM-2 cells. The TCR binding motif was identified by an Alanine scan assay and potential cross-reactivity against other HLA-A*02:01 presented peptides was excluded. Conclusion: The data shows the identification of four STAT3 D661Y peptide-reactive TCRs. To prove whether this peptide represents a naturally presented epitope, peptide presentation on HDLM2 and other HLA-A*02:01 positive cells endogenously expressing STAT3 D661Y cells should be evaluated by mass spectrometry and functional assays.

Hintergrund: Im Gegensatz zur Therapie mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) beruht die adoptive T-Zell-Therapie mit T-Zellrezeptoren (TCR) auf der klassischen TCR-Erkennung von prozessierten Epitopen, die im Zusammenhang mit MHC-Molekülen präsentiert werden und nicht auf Antikörpererkennung. Dadurch wird das Spektrum der angreifbaren Antigene erheblich erweitert, einschließlich krebsspezifischer mutierter Antigene, so genannter "Neoantigene". Daher ist das Gen Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) das ideale Ziel, da es bei Mutation ein hohes onkogenes Potenzial besitzt. Konstitutive aktivierende Mutationen in STAT3, wie D661Y, treten vor allem bei schwer zu behandelnden T-Zell-Lymphomen auf. Hier wollen wir einen hochaffinen TCR generieren, der speziell auf das auf HLA-A*02:01 beschränkte potenzielle Neoepitop IIMGYKIMYA abzielt, dass die STAT3 D661Y-Mutation umfasst. Methoden: Auf der Grundlage von isolierter RNA aus reaktiven T-Zellen, die in vitro mit STAT3 D661Y-Peptid kultiviert wurden, wurden die häufigsten variablen TCR-Sequenzen identifiziert und zusammen mit konstanten Regionen in ein retrovirales Vektor-Backbone zur Transduktion in PBMCs kloniert. Die erzeugten T-Zell-Klone wurden für funktionelle T-Zell-Assays mit der vom Hodgkin-Lymphom stammenden Zelllinie HDLM-2 und K562-Zellen verwendet, die mit HLA-A*02:01 und einem STAT3 D661Y-Minigen transduziert wurden. Die Expression der Zielpeptide wurde mittels massenspektrometrischer Analyse für K562-A2-STAT3-D661Y-Minigenzellen kontrolliert. Ergebnisse: Acht TCRs wurden identifiziert und getestet. Peptid-Titrationsexperimente zeigten eine robuste TCR-T-Zellaktivierung von vier TCRs mit hoher funktioneller Avidität gegenüber dem 10mer-Peptid IIMGYKIMYA (EC50 im nM-Bereich). In den anschließenden Kokulturen mit gegen STAT3 D661Y gerichteten TCR-T-Zellen und K562-A2-STAT3-D661Y-Minigen-transduzierten Zellen kann eine hohe IFN--Sekretion nachgewiesen werden. Überraschenderweise wurde eine robuste CD137-Hochregulierung und IFN- -Sekretion in Kokultur mit HDLM-2 nicht beobachtet, obwohl nachgewiesen wurde, dass HDLM-2-Zellen tatsächlich heterozygot für die STAT3-D661Y-Mutation sind und eine intakte Prozessierungs- und Lademaschinerie besitzen. Die Tandem-Massenspektrometrie-Analyse ergab ein fehlendes Zielepitop auf HDLM-2-Zellen. Das TCR-Bindungsmotiv wurde durch einen Alanin-Scan-Assay identifiziert, und eine mögliche Kreuzreaktivität mit anderen HLA-A*02:01-Peptiden wurde ausgeschlossen. Schlussfolgerung: Die Daten zeigen die Identifizierung von vier STAT3 D661Y-Peptid-reaktiven TCRs. Um zu beweisen, ob dieses Peptid ein natürlich präsentiertes Epitop darstellt, sollte die Peptidpräsentation auf HDLM2 und anderen HLA-A*02:01-positiven Zellen, die endogen STAT3 D661Y-Zellen exprimieren, durch Massenspektrometrie und funktionelle Assays bewertet werden.