The Developmental Role of the Serotonin System

Abstract

Drosophila melanogaster We could clone an independent gene encoding tryptophan hydroxylase (CG9122; DmTPH), as a third gene for aromatic amino acid hydroxylases (AAAH) in Drosophila melanogaster besides tyrosine hydroxylase (TH) and phenylalanine hydroxylase (PAH or Henna), opposite to the hypothesis that there are only two AAAH in Drosophila, TH and Henna with both activities PAH and TPH. We showed the enzyme activity of DmTPH to hydroxylate Trp to 5OHTrp is higher than Henna and Trp is a more suitable substrate for DmTPH than for Henna. Mouse We tried to generate TPH2 knockout mice, but the ES cells after TPH2 gene targeting could give only chimeric mice and exhibited deficiency in germ line transmission probably due to an important role of TPH2 in the spermatogenesis process. Accordingly we dicovered expression of TPH2 and not TPH1 in the testis of the mice, and this expression was correlated with sperm production. Moreover immunostaining of rat testis sections detected TPH in spermatocytes, the precursors of the mature sperms. Probably because that ES cells with a defect of TPH2 expression are not able to produce healthy sperms which are necessary for germ line transmission. Further experiments are needed to confirm these results. Zebrafish Three isoforms of TPH were cloned in zebrafish in contrast to two isoforms in other vertebrate confirming the hypothesis of a whole genome duplication during the evolution of fish and assuming the loss of the fourth TPH gene. 5HT was found in early stages of zebrafish embryos in prenervous stages (8-cell-, blastula, gastrula, and 1dpf stages) indicating a developmental role of 5HT during embryogenesis. In the later stages 5HT was found in the hatching gland, olfactory bulb also in the raphe nucleus and that was correlated with TPH2- and 5HTT expression, and in the pineal gland and that was correlated with TPHD1- and surprisingly with TPH2 expression. Also we found 5HT in cells, which we termed 5HT single cells, in intestine, dorsal root ganglia, pharyngeal arches and skin. We could identify the neural crest cells as the origin of those single cells. Sox10 regulates 5HT single cells in the skin and Foxd3 regulates the cells in the intestine, dorsal root ganglia, and pharyngeal arches. Also the 5HT2B receptor of zebrafish was cloned for the first time, and its expression was in the heart and pharyngeal arches similar as in mouse. The pharmacological loss of function test for TPH and 5HTT using the specific inhibitor pCPA for TPH, and fluoxetine for 5HTT was not effective in zebrafish in contrast to mammals. The genetic loss of function test for TPHD1 and TPH2 using the morpholino antisense oligonucleotides was effectively confirmed by 5HT immunostaining in pineal gland and in the raphe nucleus. TPH2 morphants exhibited many developmental defects in neural crest derived tissues like pharyngeal arches, peripheral and enteric nervous system, and heart. The specification of neural crest cells was not affected in TPH2 morphants as shown by the expression of different early markers. Probably the developmental defects started in their differentiation. 5HT single cells in the skin and in the pharyngeal arches were not detectable in TPH2 morphants which lack also the endodermal pouches. Other authors showed the essential signaling molecules for TPH2 induction are localized also in the endodermal pouches, probably they induce TPH2 in 5HT single cells in the pharyngeal arches. Pharmacological and genetic loss of function test for 5HT2B receptors induced defects in the function of the heart and in development the pharyngeal arches correlated with its expression pattern in these both tissues.

In dieser Doktorarbeit werden neue Aspekte von TPH für verschiedene Tiermodelle beschrieben: Drosophila melanogaster Ein neues Gen, das für Tryptophan-Hydroxylase (CG9122; DmTPH) kodiert, wurde als neues, drittes Gen in der Familie der aromatischen Aminosäure-Hydroxylasen (AAAH) in Drosophila melanogaster neben Tyrosin-Hydroxylase (TH) und Phenylalanine-Hydroxylase (PAH oder Henna) kloniert. Bisher dachte man, dass Henna die beiden Enzymaktivitäten von PAH und TPH besitzt. Die Enzymaktivität von DmTPH Trp zu 5OH-Trp zu hydroxylieren, ist höher als die von Henna, und Trp ist ein passenderes Substrat für DmTPH als für Henna. Maus Das TPH2-Gen wurde in ES- Zellen gezielt verändert, um Knock-Out-Mäuse zu erzeugen, aber die ES-Zellen generierten nur chimäre Mäuse ohne Keimbahngängigkeit wahrscheinlich aufgrund einer wichtigen Rolle von TPH2 in der Spermatogenese. Dem entsprechend wurde die Expression von TPH2, aber nicht TPH1, im Hoden von Mäusen, Ratten und Menschen entdeckt. Zebrafisch Drei Isoformen von TPH wurden im Zebrafisch im Gegensatz zu zwei Isoformen bei anderen Wirbeltieren kloniert, was die Hypothese einer Genom-Verdoppelung während der Evolution des Fisches bestätigt, wenn man den Verlusts eines vierten TPH-Gens annimmt. 5HT wurde in frühen Stadien von Zebrafischembryonen in (8-Zellembryonen, Blastula-, Gastrula-, und 1dpf-Stadien) gefunden, was auf eine Rolle von 5HT während der Embryogenese auch vor der Neuronenentwicklung schließen lässt. In späteren Stadien wurde 5HT in der "Hatching"-Drüse, in Geruchsneuronen und im Raphe nucleus gefunden, dort zusammen mit der Expression von TPH2 und 5HTT. In der Epiphyse wurde 5HT parallel mit der Expression von TPHD1 und, überraschend, auch mit der Expression von TPH2 gefunden. 5HT wurde auch in Zellen gefunden, die 5HT-Einzelzellen genannt wurden, im Darm, den dorsalen Wurzelganglien, den Kiemenbögen und der Haut. Durch Ausschaltung von Genen, die für die Entwicklung von Subpopulationen von Neuralleistenzellen verantwortlich sind, wurden diese Zellen als Ursprung der 5HT-Einzelzellen identifiziert. Ausschaltung von Sox10 reduzierte die 5HT-Einzelzellen in der Haut, und von Foxd3 die Zellen im Darm, den Wurzelganglien, und Kiemenbögen. Erstmal wurde auch der 5HT2B-Rezeptor des Zebrafisches kloniert, und dessen Expression wurde in den Herz und Kiemenbögen gefunden wurde, ähnlich wie bei der Maus. TPH2-"Knock down"-Fische wurden unter dem Einsatz von Morpholino-Antisense- Oligonucleotiden erzeugt. Sie zeigten viele Entwicklungsdefekte in von Neuralleisten abgeleiteten Geweben wie den Kiemenbögen, dem peripheren und enterischen Nervensystem und dem Herz. Die Spezifizierung von Neuralleistenzellen war in TPH2-"Knock down"-Fischen nicht betroffen, wie durch die Expression von verschiedenen frühen Markern gezeigt wurde. 5HT- Einzelzellen waren in der Haut und in den Kiemenbögen in TPH2-"Knock down"-Fischen nicht nachweisbar. Pharmakologische und genetische Versuche zum Funktionsverlust von 5HT2B-Rezeptoren zeigten Defekte in der Funktion des Herzens und in der Entwicklung der Kiemenbögen, was dem Expressionsmuster in beiden Geweben entspricht.