dc.contributor.author
Gerrits, Michael
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:56:41Z
dc.date.available
2002-01-10T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4448
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8648
dc.description
#### Titelblatt, Inhalt, Zusammenfassung, Summary
#### 1\. Einleitung 1
#### 1.1 in vitro Translation 4
#### 1.2 Die Einführung unnatürlicher oder modifizierter Aminosäuren in
Proteine 6
#### 1.3 Struktur und Funktion der tRNA 10
#### 1.4 Die tRNA im Kontext der Translation 16
#### 1.5 amber-Suppression 23
#### 2 Problemstellung 28
#### 3\. Material 29
#### 3.1 Chemikalien, Biochemica, Lösungsmittel 29
#### 3.2 Radiochemikalien 30
#### 3.3 Nukleinsäuren, Proteine, Enzyme 30
#### 3.4 Kits 31
#### 3.5 Sonstige Materialien und Geräte 31
#### 3.6 Zellstämme 33
#### 4\. Methoden 34
#### 4.1 Escherichia coli -Zellkulturen 34
#### 4.2 Methoden für die Herstellung, Aufreinigung und Analytik von
Nukleinsäuren 36
#### 4.3 In vitro Translation 61
#### 4.4 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese nach Laemmli (Laemmli 1970) 66
#### 4.5 TCA-Fällung von Protein und RNA 67
#### 4.6 Detektion von ß-Strahlung 68
#### 4.7 Quantifizierung der spezifischen Aktivität von Chloramphenicol-
Acetyl-Transferase (CAT-Assay) 69
#### 5\. Ergebnisse 71
#### 5.1 Aufbau und Charakterisierung von amber-Suppressions-Assays 72
#### 5.2 Vergleich der Suppressionsaktivität von Gesamt-tRNA-Präparationen
aus verschiedenen Escherichia coli-amber-Suppressor-Zellstämmen 78
#### 5.3 Konstruktion von Plasmiden für die T7-Transkription von tRNAs 86
#### 5.4 Einsatz einer chemisch aminoacylierten amber-Suppressor-tRNA
(?-DnsLys-tPheY) 87
#### 5.5 Untersuchungen zur Endheterogenität von T7-transkribierten tRNAs 91
#### 5.6 Prozessierung, Aminoacylierung und tRNA-Reparatur ? ihr Einfluß auf
die Aktivität zweier Leucyl-amber-Suppressor-tRNAs in der in vitro Translation
106
#### 5.7 Vergleich der Suppressionseffizienz von verschiedenen in vitro
transkribierten amber-Suppressor-tRNA-Spezies 119
#### 6\. Diskussion 136
#### 6.1 Suppression in vivo und in vitro 137
#### 6.2 Struktur der Aminoacyl-tRNA und Suppressionseffizienz 142
#### 6.3 Konsequenzen der Untersuchungen zur Suppressionseffizienz für den
Einsatz chemisch aminoacylierter tRNAs 149
#### 6.4 Ausblick 152
#### 8\. Abkürzungen 158
#### 9\. Literatur 161
#### 9.1 Eigene Publikationen 180
#### 10\. Anhang 181
#### Danksagung 192
dc.description.abstract
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, Wege aufzuzeigen, die die
gezielte Einführung unnatürlicher Aminosäuren in Proteine mit der Methodik
des Einsatzes chemisch aminoacylierter amber-Suppressor-tRNAs verbessern. Um
die besonderen Bedingungen beim Einsatz von amber-Suppressor-tRNAs in der
zellfreien Proteinbiosynthese zu beleuchten, wurden sowohl in vivo exprimierte
als auch in vitro transkribierte amber-Suppressor-tRNAs auf unterschiedlichen
Funktionsebenen innerhalb eines Escherichia coli in vitro-Translationssystems
charakterisiert. Letztendlich ermöglichten die Untersuchungen eine Einstufung
der Suppressionseffizienz von sieben verschiedenen in vitro transkribierten
amber-Suppressor-tRNA-Spezies.
Die zielgerichtete Insertion einer unnatürlichen Aminosäure in ein Protein
konnte innerhalb der vorliegenden Arbeit anhand der Insertion von ?-Dansyl-
Lysin in FABP demonstriert werden. Nicht unerwartet war der Einbau der
unnatürlichen Aminosäure äußerst ineffizient. Als eine weitere Limitation der
dem Einbau unnatürlicher Aminosäuren zugrunde liegenden Methodik erwies sich
die Aufreinigung größerer Mengen an homogenen in vitro transkribierten
verkürzten tRNAs, die für die Herstellung der mit der unnatürlichen Aminosäure
beladenen tRNA eine unabdingbare Voraussetzung ist. Die Aufreinigung homogener
tRNAs war aufgrund der starken 3'-Endheterogenität der Transkriptionsprodukte
äußerst problematisch. Sowohl die Homogenität der tRNA als auch die absolute
Ausbeute ließen sich deutlich verbessern, indem die normalerweise für die
Transkription mit T7-RNA-Polymerase gebräuchliche Temperatur von 37°C auf ein
Optimum von 44°C erhöht wurde. Zudem zeigten unterschiedliche Präparationen
von T7-RNA-Polymerase verschieden starke n+1-Aktivitäten.
Zur Untersuchung der Aktivitäten in vivo exprimierter amber-Suppressor-tRNAs,
wurden Gesamt-tRNA-Präparationen aus insgesamt 10 verschiedenen, bei Kleina et
al. (1990) beschriebenen Escherichia coli-amber-Suppressor-Zellstämmen in der
in vitro-Translation eingesetzt. Die Relationen in den
Suppressionsaktivitäten der amber-Suppressor-tRNAs für Leucin, Histidin,
Tyrosin und Serin entsprachen denen in vivo. Die geringere
Suppressionsaktivität anderer untersuchter amber-Suppressor-tRNAs in vitro
gibt möglicherweise einen Hinweis darauf, daß die Aktivität einiger Aminoacyl-
tRNA-Synthetasen im in vitro Translationssystem reduziert ist.
Prozessierung, Reparatur und Aminoacylierung in vitro transkribierter tRNAs
und ihre Beziehung untereinander wurden eingehend untersucht. Homogene tRNA-
Präparationen mit korrektem CCA-Ende konnten durch eine Prozessierung oder
durch die Regeneration des 3'-Endes der in vitro transkribierten tRNAs in der
S100-Enzymfraktion des Translationssystems erhalten werden. Die Prozessierung
verlängerter tRNAs und die Reparatur verkürzter tRNAs innerhalb des
Gesamtsystems erwiesen sich als nicht limitierend für die Proteinbiosynthese.
Letztendlich konnte die unterschiedliche Suppressionsaktivität der Transkripte
von sieben amber-Suppressor-tRNA-Spezies (tRNASerCUA {su+1}, tRNATyrCUA
{su+3}, tRNALeuCUA {su+6}, tRNALeu5CUA, tRNAPheCUA, tRNAHisCUA und
tRNAAla1CUA) auf strukturelle Eigenschaften der entsprechenden Aminoacyl-
tRNAs zurückgeführt werden. Als Maß für die Suppressionseffizienz diente die
Häufigkeit der ribosomalen tRNA-Selektion im Vergleich zur Häufigkeit der
Selektion von RF1. Alle untersuchten amber-Suppressor-tRNAs enthielten die als
ideal für die Suppression beschriebene Nukleotidfolge 5'C34U35A36A37A383'
innerhalb ihrer Anticodonschlaufe. Auch in Anwesenheit dieser Sequenz
unterschieden sich die Suppressionseffizienzen der einzelnen amber-Suppressor-
tRNAs sehr stark. Die Rate der tRNA-Selektion des stärksten Suppressors,
tRNASerCUA, war über 20 mal so hoch wie die Rate der tRNA-Selektion für
tRNAAla1CUA, die die Suppressionseffizienz der zur Zeit für die Einführung
unnatürlicher Aminosäuren verwendeten amber-Suppressor-tRNAs repräsentiert.
Generell war die Suppressionseffizienz um so besser, je mehr die Sequenz der
ursprünglichen Wildtyp-tRNA der Sequenz der aus ihr abgeleiteten amber-
Suppressor-tRNA ähnelte. Mit zunehmender Anzahl der Mutationen, die nötig
waren, die Sequenz 5'C34U35A36A37A383' innerhalb der Anticodon-Schlaufe zu
erhalten, nahm die Suppressionseffizienz der tRNAs ab. Insofern unterstützen
die Ergebnisse die Theorie des "Extended Anticodon" (Yarus 1982). Die beiden
mit Abstand besten Suppressoren tRNASerCUA und tRNATyrCUA enthalten die Base
C32 innerhalb der Anticodon-Schlaufe. Wichtige Strukturelemente für die
Suppression liegen möglicherweise auch außerhalb des Anticodon-Armes. Es
ergaben sich Hinweise darauf, daß eine TypII-Struktur der tRNA die Suppression
begünstigt.
Die im Rahmen der Biotechnologie bedeutendste Konsequenz aus der vorliegenden
Arbeit ist, daß die zur Zeit für die Einführung unnatürlicher Aminosäuren in
Proteine verwendeten amber-Suppressor-tRNAs relativ schwache amber-
Suppressoren sind. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sollte die
Konstruktion wesentlich verbesserter amber-Suppressoren und damit eine sehr
viel effizientere Insertion unnatürlicher Aminosäuren in Proteine möglich
sein.
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de
dc.description.abstract
The introduction of unnatural amino acids into proteins can be achieved by the
use of an amber suppressor tRNA, that has been chemically acylated with the
desired amino acid and that is not a substrate for the natural aminoacyl tRNA
synthetases. The addition of the charged amber suppressor tRNA to the protein
biosynthesis reaction results in site specific incorporation of the amino acid
into the protein. However very often the usually applied methodology does not
lead to sufficient amounts of mutant protein. The goal of this work was to
expand our knowledge of in vitro amber suppression expecting that the strategy
mentioned above can be applied more general.
Within the presented work the site specific incorporation of an unnatural
amino acid could be demonstrated by the introduction of ?-dansyl lysine into
FABP (fatty acid binding protein). As expected the incorporation of the
unnatural amino acid was very inefficient. A further limitation of the
methodology proved to be the preparation of large amounts of shortened tRNA
molecules, which are necessary to produce the chemically acylated tRNA. The
high level of 3'-end heterogeneity of the in vitro transcription products
strongly impedes the purification of homogenous tRNA. The homogeneity and the
amount of the tRNAs during T7-transcription could clearly be improved by
increasing the reaction temperature from 37°C to an optimum temperature of
44°C. Additionally, various preparations of T7-RNA-Polymerase showed different
n+1-activities.
To investigate the activities of amber suppressor tRNAs expressed in vivo,
total tRNA from 10 different Escherichia coli amber suppressor strains (Kleina
et al. 1990) was prepared and employed in cell-free translation. The relations
between the suppression activities of the amber suppressors for leucine,
histidine, tyrosine and serine in vitro corresponded to the in vivo results of
other authors. In contrast to those four the suppression activities of other
amber suppressors were decreased in vitro indicating that the activities of
the corresponding amino acyl tRNA synthetases may be reduced.
Processing, repair and aminoacylation of in vitro transcribed tRNAs and the
relation of these processes to each other were investigated in-depth.
Incubation of 3'-shortened or 3'-prolonged heterogenous in vitro transcription
products in the S100 enzyme fraction of the total translation system resulted
in homogenous tRNA populations with correct 3'-terminal CCA-ends. Processing
of prolonged tRNAs and repair of shortened tRNAs in the whole translation
system were shown not to be limiting for protein biosynthesis in vitro.
The suppression activities of the transcripts of seven different amber
suppressor tRNA species (tRNASerCUA {su+1}, tRNATyrCUA {su+3}, tRNALeuCUA
{su+6}, tRNALeu5CUA, tRNAPheCUA, tRNAHisCUA and tRNAAla1CUA) were shown not to
be limited by aminoacylation. Therefore the suppression activities of these
tRNAs reflects structural properties of their aminoacylated counterparts.
Suppression efficiency was defined as the frequency of ribosomal tRNA
selection divided by the frequency of RF1 selection. The anticodon loops of
all tRNAs contained the sequence 5'C34U35A36A37A383' which is ideal for
efficient suppression as known from other studies. Still, in the presence of
this sequence suppression efficiencies varied over a large range. The rate of
tRNA selection was 20 times higher for the strongest suppressor, tRNASerCUA,
compared to the efficiency of the weakest one, tRNAAla1CUA, which represents
the suppression efficiency of the actual tRNAs used for chemical
aminoacylation. In general the more the sequence of the amber suppressor tRNA
reflected the sequence of the original wild type tRNA, from which it was
deviated, the better the suppression efficiencies became. With increasing
number of nucleotide exchanges, that were necessary to get the sequence
5'C34U35A36A37A383' into the anticodon loop of the amber suppressor,
suppression efficiencies decreased, indicating that tRNA sequences have been
evolved to support optimal interaction between codon and anticodon, as it is
postulated in the "Extended Anticodon" (Yarus 1982). The two best amber
suppressors by far, tRNASerCUA and tRNATyrCUA, both contain the base C32
inside their anticodon loop. There is also some evidence, that certain
structural features important for suppression are localized outside the
anticodon arm and that these structural features are found mainly in typeII-
tRNAs.
The most important conclusion resulting from this work within the field of
biotechnology is, that the actual amber suppressor tRNAs used for chemical
aminoacylation are comparably weak suppressors. A logical step from this work
is the construction of new amber suppressor tRNAs with higly improved
suppression efficiences for chemical aminoacylation. Therefore the present
work should allow a much improved incorporation of unnatural amino acids into
proteins in the future.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
cell-free translation
dc.subject
amber suppressor tRNA
dc.subject
aminoacylation
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Funktion und Effizienz von amber-Suppressor-tRNAs in der zellfreien
Proteinbiosynthese
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Volker A. Erdmann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Dr. med. Manfred Schweiger
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Ortwin Simon
dc.date.accepted
2001-11-05
dc.date.embargoEnd
2002-01-16
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002000049
dc.title.translated
function and efficiency of amber suppressor tRNAs in cell-free protein
biosynthesis
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000571
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/4/
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