Etablierung eines automatischen Verfahrens für die In-Situ-Hybridisierung zur Analyse differentiell exprimierter Gene im runx2-Mausmodell

Abstract

Runx2 ist ein essentieller Faktor der Skeletogenense. Die heterozygote Mutation dieses Gens verursacht beim Menschen das Skelettmalformations-Syndrom Cleidocraniale Dysplasie. Runx2-defiziente Mäuse weisen einen Verlust von hypertrophen Chondrozyten und Knochen auf. Wir verglichen die Expresssionsprofile von embryonalen murinen Wildtyp- und Runx2-/--Humeri um neue Transkripte zu identifizieren, die potentiell in die Knorpel- und Knochenentwicklung involviert sind. Nach der Identifizierung von 53 differentiell eprimierten Genen durch zwei unabhängige Oligonukleotid Microarray Hibridisierungen und quantitativen RT-PCR Experimenten, wurde eine In-Situ-Hybridisierung mit Digoxigenin-markierter RNA auf Extremitätenschnitten von Mäusen E15,5 durchgeführt. Für diesen Schritt war es zunächst notwendig, den Prozess der Kryoschnittherstellung und das Verfahren der semi-automatischen In-Situ-Hybridisierung durch den Tecan Genesis RSP 150 zu etablieren. Für 35 Gene konnte eine eindeutige und reproduzierbare Expression gefunden werden und 32 dieser Gene zeigten eine skelettäre Expression. Während 15 der Gene eine bekannte Rolle im Kochen und/oder Knorpel besitzen, konnten wir 15 bekannte Gene, denen noch keine Rolle in der Sklettentwicklung zugeschrieben ist, sowie zwei gänzlich unbekannte Gene identifizierten. Die Ergebnisse sind auf einer eigens dafür konzepierte Website einsehbar.

Runx2 is an essential factor for skeletogenesis and heterozygous mutations in the human RUNX2 gene are the cause for the skeletal malformation syndrome cleidocranial dysplasia. Runx2-deficient mice lack hypertrophic cartilage and bone. We compared the expression profiles of wildtype and Runx2-/- murine embryonal humeri to identify new transcripts potentially involved in the cartilage and bone development. After identifying 53 differentially expressed genes by two independent oligonucleotide-microarray hybridizations and quantitative RT-PCR experiments, digoxigenin-labeled RNA in situ hybridization on E15.5 limb sections was performed to analyse the expression. For this step it was necessary to establish the procedure of cryosectioning and the process of a semi-automated in situ hybridization using the Tecan Genesis RSP 150. For 35 genes unequivocal and reproducable in situ hybridisation results were obtained and 32 of them showed skeletal expression. While 15 of this genes have a known role in bone and/or cartilage, we identified 15 known genes that have not yet been implicated in skeletal development and two entirely new transcripts. Results are viewable at an expressly created website.