Development of methods to determine pollution effects on skin and to measure the efficacy of anti-pollution formulations

Abstract

The significant relevance of air pollution increased in our society in recent years due to its adverse health effects on animals and humans. This is caused by the increasing amount of pollutants worldwide. These pollutants also have an effect on the skin as it comes into contact every day. It is important to address all the possible aspects of danger to prevent such damage. In addition, pollutants such as cigarette smoke can lead to premature skin ageing, damage to the skin barrier, pigmentation disorders, and cell damage which is caused by free radicals. These factors can worsen symptoms for patients with existing skin conditions, like atopic dermatitis and acne. Air pollution can also cause new conditions to develop. The extent of damage on the skin caused by cigarette smoke is not yet clear, and it remains uncertain how to protect the skin from it. As a result, skincare products claiming an "anti-pollution effect" have been released to the markets in recent years. Currently, there are no proper methods to produce meaningful results for measuring the effect of pollution on the skin. It is important to assess the level of risk cigarette smoke poses to the skin or the effectiveness of applied substances in providing protection. For risk management, an unambiguous determination was necessary and hence it was deemed essential to establish cigarette smoke exposure method. For this purpose, two specially designed exposure chambers were constructed to expose ex vivo and in vivo skin tissue to cigarettes smoke. The concentration of smoke in the chamber was determined initially by a commercial particle measuring device, which was capable of measuring particles ranging from concentration 0.001 to a maximum of 400 mg/m³. It was found that the smoke from one cigarette exceeded the quantifiable levels measured with the particle measuring device in the chamber. A method was created to establish a correlation between the particle concentration and the nicotine concentration within the chamber that could come into contact with the skin. Nicotine acted as a surrogate parameter for cigarette smoke in this work. A consistent smoking regime was established for subsequent measurement of the impact of skin exposure. To quantify the nicotine content on the skin, a filter paper was positioned next to each skin sample. The sample was extracted with ethanol and the absorbance of nicotine was measured at a wavelength of 262 nm, using a UV-Vis spectrometer. A calibration curve was generated with pure substance nicotine. The results reveal a statistically significant positive correlation between the measured nicotine concentration and the particle concentration in the chamber. Once a reproducible method for exposing the skin to cigarette smoke had been established, two new techniques have been devised for measuring the impact of cigarette smoke on the skin. Prior investigations have demonstrated that the generation of free radicals leads to oxidative stress and is the main mechanism of skin damage caused by air pollution. Free radicals can be measured via electron spin resonance (EPR) spectroscopy. The study evaluated the impact of cigarette smoke on excised porcine skin with different spin probes. Prior research has proven that cigarette smoke can induce free radicals in the skin. There is a dose dependency between the measured nicotine concentration and the radical production in the skin. The combination of UVA and cigarette smoke leads to an increase in radical formation due to synergistic effects. Furthermore, the impact resulting from induced oxidative stress in the excised porcine skin was gauged via heightened autofluorescence utilizing the confocal Raman microscope (CRM). The autofluorescence technique was effectively transferred to in vivo studies. Results revealed that the measured autofluorescence was higher in test subject post-exposure to cigarette smoke than pre-exposure. Notwithstanding, the method is restricted to skin types I-III as high levels of melanin in the skin can disturb the measurements. The specific mechanisms underlying the observed increase in autofluorescence have yet to be determined. Nevertheless, it has been verified that oxidative stress, rather than cigarette smoke components, is accountable for the increase in autofluorescence. Both methods were used to evaluate the efficacy of different formulations containing of antioxidants and chelating agents. Notably, the formulation incorporating epigallocatechin-3-gallate (EGCG), a key ingredient found in green tea (Camellia Sinensis), exhibited the optimal performance in both methods. While both methods seem similar, the EPR method is somewhat limited. Specifically, for this test procedure, it is important that the tested agent does not react with the spin probe. The efficacy of antioxidants in the formulations should be optimally measured. For instance, chelating agents are based on a distinct active principle that cannot be optimally measured through the EPR method. In contrast, the CRM method can efficiently measure all active ingredient groups without the need for additional markers. It is also a promising method to apply in vivo. No additional UVA irradiation is necessary either, making the CRM method the superior approach for measuring the effectiveness of anti-pollution products.

Das Thema Umweltverschmutzung ist in den letzten Jahren immer relevanter für die Gesellschaft geworden. Die Menge an Schadstoffen in der Luft nimmt weltweit kontinuierlich zu und verursacht erhebliche gesundheitliche Probleme. Auch für die Haut haben diese Schadstoffe eine hohe Bedeutung. Darüber hinaus müssen wir uns auch mit anderen Aspekten der Umweltverschmutzung auseinandersetzen. Schadstoffe wie Zigarettenrauch können vorzeitige Hautalterung, Schädigungen der Hautbarriere, Pigmentstörungen und Zellschäden durch freie Radikale verursachen. Diese können die Symptome von Patienten mit bereits bestehenden Hautkrankheiten wie atopischer Dermatitis und Akne verschlimmern oder sogar neue Krankheiten auslösen. Obwohl nicht vollständig geklärt ist, wie schädlich Zigarettenrauchexposition für die Haut ist und wie man die Haut effektiv davor schützen kann, wurden in den letzten Jahren Hautpflegeprodukte mit einer "Antipollution-Wirkung" entwickelt. Bisher gibt es keine etablierten Methoden, um aussagekräftige und einfache Ergebnisse zu erzielen, die den Einfluss von Umweltverschmutzung auf der Haut messen können. Es ist wichtig, den Gefährdungsgrad von Zigarettenrauch auf die Haut oder die Schutzwirkung applizierter Substanzen eindeutig zu bestimmen. Um eine eindeutige Bestimmung des Gefährdungsgrades zu gewährleisten, sollte eine reproduzierbare Zigarettenrauchexposition durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wurden zwei Expositionskammern gebaut, die die Haut ex vivo und in vivo mit Zigarettenrauch exponieren. Die Konzentration in der Kammer wurde anfangs mit einem kommerziellen Partikelmessgerät ermittelt, welches Konzentrationen von 0,001 bis maximal 400 mg/m³ erfassen konnte. Der Rauch einer Zigarette überschritt den maximalen Messwert in der Kammer. Aus diesem Grund wurde eine Methode entwickelt, um die Partikelkonzentration mit der Nikotinkonzentration zu korrelieren, welcher die Haut in der Kammer ausgesetzt war. Nikotin diente hierbei als Surrogatparameter für den Zigarettenrauch im Allgemeinen. Ein reproduzierbares Berauchungsregime wurde eingerichtet, um später den Effekt der Hautexposition zu messen. Um den Nikotingehalt auf der Haut zu quantifizieren, wurde neben jeder Hautprobe ein Filterpapier platziert. Dieses wurde anschließend extrahiert und bei einer Wellenlänge von 262 nm mit einem UV-Vis Spektrometer gemessen. Ferner wurde eine Kalibrierkurve mit dem Reinstoff Nikotin erstellt. Es konnte eine signifikante positive Korrelation zwischen der gemessenen Nikotinkonzentration und der Partikelkonzentration in der Kammer nachgewiesen werden. Nachdem eine reproduzierbare Methode für die Exposition gegenüber Zigarettenrauch etabliert wurde, wurden zwei neue Methoden entwickelt, um den Effekt von Zigarettenrauch auf der Haut zu messen. Vorherige Untersuchungen haben gezeigt, dass die Entstehung von freien Radikalen zu oxidativem Stress führt und der hauptsächliche Mechanismus für Schäden der Haut durch Luftverschmutzung ist. Es wurde nachgewiesen, dass Zigarettenrauch allein in der Lage ist, freie Radikale in der Haut zu induzieren. Es besteht eine Dosisabhängigkeit zwischen der gemessenen Nikotinkonzentration und der Radikalproduktion in der Haut. Die Kombination von UVA-Bestrahlung und Zigarettenrauch führte zu einer vermehrten Radikalbildung durch synergistische Effekte. Zusätzlich konnte der durch induzierten oxidativen Stress in der exzidierten Schweinehaut verursachte Effekt anhand der erhöhten Autofluoreszenz durch das konfokale Ramanmikroskop (CRM) gemessen werden. Die CRM-Methode konnte erfolgreich auf in vivo übertragen werden. Es wurde gezeigt, dass die gemessene Autofluoreszenz bei Probanden nach Exposition gegenüber Zigarettenrauch höher war als vor der Exposition. Die Methode ist jedoch auf die Hauttypen I-III beschränkt, da ein hoher Melaningehalt in der Haut die Messungen stören kann. Die genauen Prozesse, die zu dieser erhöhten Autofluoreszenz führen, konnten noch nicht ermittelt werden. Jedoch wurde bestätigt, dass oxidativer Stress für den Anstieg in Autofluoreszenz verantwortlich ist und nicht die Bestandteile des Zigarettenrauchs. Beide Methoden wurden angewendet, um die Effektivität bezüglich der Antipollutionwirkung von einzelnen Formulierungen mit Antioxidantien und Chelatbildnern zu überprüfen. Die Formulierung mit Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) hat dabei am besten abgeschnitten. Dieser Wirkstoff ist ein Hauptbestandteil von grünem Tee (Camellia Sinensis). Beide Methoden sind vergleichbar; jedoch gibt es bei der EPR-Methode Einschränkungen. Bei dieser Testmethode darf das Testprodukt einerseits nicht mit der Spinsonde reagieren. Andererseits wird die Effektivität von Antioxidantien in den Formulierungen optimal gemessen. Dagegen beruhen Chelatbildner auf einem anderen Wirkprinzip, das von der EPR-Methode nicht optimal erfasst wurde. Die CRM-Methode erfasst alle Wirkstoffgruppen optimal und benötigt keine zusätzliche Markersubstanzen zur Messung der Wirkung von Zigarettenrauch und für die Exposition des Rauches ohne Creme konnte die In-Vivo-Tauglichkeit nachgewiesen werden. Es ist auch keine zusätzliche UVA-Bestrahlung erforderlich, weshalb aus bisheriger Sicht die CRM-Methode die bessere Methode zur Messung der Wirksamkeit von Anti-Pollution-Produkten ist.