Plants can mobilize efficient defenses against eggs laid by herbivorous insects on their leaves, as well as against the feeding insects. Various studies showed that angiosperm plants able respond to environmental cues that indicate impending insect infestation. Thus, the plants prepare and improve their defenses against the actual infestation. The mechanisms of this phenomenon – termed "priming" of inducible defense – were hardly investigated in gymnosperm species in the beginning of my doctorate studies. For the gymnosperm species Pinus sylvestris (Scots pine), it was known that exposure of this tree to the sex pheromone of the herbivorous sawfly Diprion pini results in improved defense against sawfly eggs. Furthermore, previous studies showed that Scots pine responds to eggs of D. pini with improved defense against later hatching sawfly larvae. However, prior to this thesis, little information was available about the mechanisms of these responses. Furthermore, a proteinaceous elicitor of pine defenses against sawfly eggs had been identified prior to this thesis; however, it was unknown so far whether this elicitor can induce similar transcriptional changes as the natural egg deposition does. To address these gaps in knowledge (outlined in detail in the general introduction of this thesis), I investigated the interactions between the gymnosperm pine Pinus sylvestris and the herbivorous sawfly Diprion pini. In a first study, pine trees were exposed to the sawfly's sex pheromone and subsequently to egg deposition. The survival rate of eggs laid on pheromone-exposed pine was 20 % lower than the survival rate of eggs laid on control (untreated) pine. My analyses revealed that pheromone-exposed and subsequently egg laden pine needles accumulated significantly higher concentrations of hydrogen peroxide than non-exposed, egg laden pine needles. The strong accumulation of hydrogen peroxide might initiate the amplification of defense-relevant further responses, but might also directly harm the eggs. Furthermore, my chemical analysis by coupled gas chromatography – mass spectrometry revealed that pine trees exposed to the pheromone for 24 h did not emit pheromone components any more already six hours later. My electrophysiological study of the antennal response of D. pini to the tested pheromone components revealed that males – as expected - showed clear responses, whereas females did not. Thus, in contrast to some lepidopteran females, D. pini females cannot perceive their pheromones and exploit them as abundance sensor for abundance-adjusted regulation of egg deposition. The second study of this thesis addressed the transcriptomic and phytohormonal response of P. sylvestris to (a) egg deposition, (b) larval feeding and (c) egg deposition and subsequent larval feeding of D. pini. The results revealed comparably strong pine transcriptomic responses to both sawfly eggs and larval feeding. Interestingly, the regulated genes in response to sawfly oviposition and larval feeding were of remarkably similar types and putative functions. These commonly regulated genes were mostly related to mechanisms like cell wall modification, cell death, jasmonic acid signaling and other defense related groups. However, pine trees laden with sawfly eggs showed a weaker transcriptomic response to subsequent feeding damage than control trees without prior egg deposition. This finding differs from so far known responses in angiosperm species; the transcriptomes of egg-laden angiosperms are known to show stronger or earlier responses to feeding. The very strong transcriptomic pine response to D. pini oviposition might already prepare the plant well for increased defense against hatching larvae, thus rendering an amplified response of egg-laden pine to later feeding damage by the larvae would be redundant. However, some results showed similar and thus possibly phylogenetically conserved responses to insect eggs and larvae in angiosperm species and the here analyzed gymnosperm species. For example, larval feeding damage induced a significant increase in the SA concentration in previously egg laden, but not in egg-fee pine needles, which was also observed in leaves of several angiosperm species. The third study addressed the question of how the known egg-associated elicitor of pine defenses against sawfly eggs affects the expression of defense-related pine genes. The proteinaceous, annexin-like elicitor – called diprionin – was first heterologously expressed and subsequently applied onto pine needles that had been slit to mimic the ovipositional wounding, which sawfly females inflict to pine needles when laying their eggs. Expression levels of various, potentially defense-related genes in egg laden and diprionin treated needles were determined by qPCR analyses. These were genes involved in the regulation of reactive oxygen species and calcium mediated signal transduction, as well as genes relevant for the biosynthesis of phenylpropanoid and terpenoid secondary metabolites. These genes showed similar expression patterns in egg laden and diprionin treated needles, thus corroborating the relevance of diprionin for defense against sawfly eggs. However, pathogenesis related (PR) genes were differentially expressed when comparing diprionin treated trees and pine with natural egg deposition, suggesting further compounds and/or conditions to be involved in the defense response. The general discussion of this thesis focuses on a comparison of pheromone-mediated and egg-mediated pine defense and priming mechanisms and the (dis)similarities of defense responses against different stages of the sawfly infestation. Furthermore, it classifies diprionin in comparison to other known insect-associated plant defense elicitors and tries to elucidate possible ways of plant tissue interaction. In a nutshell, this thesis on the interactions between P. sylvestris and the sawfly D. pini demonstrated that… … the improved defense of pheromone-exposed pine against sawfly eggs is linked with enhanced accumulation of hydrogen peroxide … the analyzed pine transcriptome shows a very strong response to sawfly egg deposition; this egg-induced response largely overlaps with the transcriptomic response to sawfly larval feeding damage …in contrast to angiosperms, egg laden pine shows a weaker transcriptomic response to larval feeding instead of a stronger response … diprionin, the elicitor of pine defense associated with D. pini eggs, affects the expression of several defense-related pine genes to a similar extent as D. pini egg deposition does.
Pflanzen können sich nicht nur gegen pflanzenfressende Insekten wehren, sondern bereits gegen Insekteneiablagen auf ihren Blättern. Verschiedene Untersuchungen an Angiospermen haben gezeigt, dass Pflanzen auf solche Umweltreize reagieren, die auf bevorstehenden Insektenbefall hinweisen, um daraufhin ihre Verteidigung gegen den tatsächlichen Befall vorzubereiten und zu verbessern. Die Mechanismen dieses Phänomens der "Vorbereitung" (engl. Priming) auf befallsinduzierte Verteidigung war zu Beginn dieser Doktorarbeit bei Gymnospermen wenig untersucht. Für die Gymnospermen-Art Pinus sylvestris war bekannt, dass sie auf das Sexualpheromon der herbivoren Blattwespe Diprion pini mit verbesserter Abwehr gegen die Eiablagen dieses Insekts reagiert. Darüber hinaus war bekannt, dass diese Waldkiefer auf Eiablagen von D. pini mit verbesserter Abwehr gegen schlüpfende Larven reagiert. Es lagen aber zu Beginn dieser Dissertation nur wenige Informationen über die Mechanismen dieser Reaktionen vor. Weiterhin war ein mit der Eiablage von D. pini identifizierter proteinöser Elicitor der Verteidigung von P. sylvestris gegen die Eier kurz vor Beginn dieser Arbeit beschrieben worden. Es war aber noch unklar, ob eine synthetische Version dieses Elicitors in P. sylvestris ähnliche transkriptionelle Änderungen auslöst wie die Eiablage selbst. Um diese in der Einleitung dieser Dissertation näher vorgestellten Wissenslücken zu füllen, wurde als Untersuchungssystem für diese Doktorarbeit die Waldkiefer P. sylvestris und dessen Interaktion mit der herbivoren Blattwespe D. pini gewählt. In einer ersten Studie wurden Waldkiefern dem Sexualpheromon und anschließend der Eiablage der Blattwespen ausgesetzt. Aus Eiern an Sexualpheromon-exponierten Kiefern schlüpften 20% weniger Larven als aus den Eiern an Kontroll-Kiefern, die nicht den Pheromonen ausgesetzt waren. Meine Analysen zeigten, dass Pheromon-exponierte, eierbelegte Kiefernnadeln signifikant mehr Wasserstoffperoxid anreicherten als eierbelegte Nadeln der Kontrollbäume. Die Akkumulation von Wasserstoffperoxid könnte zum einen eine Verstärkung der verteidigungsrelevanten Mechanismen initiieren, aber zum anderen auch direkt die Eier stark schädigen. Weiterhin zeigten meine chemischen Analysen mittels gekoppelter Gaschromatographie-Massenspektrometrie, dass die Waldkiefer nach 24-stündiger Pheromonexposition bereits nach sechs weiteren Stunden selbst keine Pheromone "ausdünstete". Meine elektrophysiologischen Analysen der Antennenreaktion von D. pini auf die getesteten Pheromonsubstanzen ergaben, dass die Männchen – wie erwartet – sehr gut auf die Substanzen reagierten, die Weibchen jedoch nicht. Somit können D. pini Weibchen im Gegensatz zu einigen Schmetterlingsarten ihre eigenen Pheromone nicht wahrnehmen und daher auch nicht entsprechend als "Abundanzfühler" für eine Abundanz-justierte Eiablageregulation nutzen. Die zweite Studie dieser Dissertation befasste sich mit der Transkriptom- und Phytohormonreaktion von P. sylvestris auf (a) die Eiablage, (b) Larval-Fraß und (c) die Eiablage und anschließendem Larval-Fraß durch D. pini. Die Ergebnisse zeigten vergleichbar starke Reaktionen des Transkriptoms sowohl auf die Blattwespeneier als auch auf den Larval-Fraß. Interessanterweise waren die Gene, welche als Antwort auf die Eiablage der Blattwespen und den Larval-Fraß reguliert wurden, von erstaunlich ähnlicher Natur und ähnlicher möglicher Funktion. Diese Gene standen hauptsächlich im Zusammenhang mit Mechanismen wie Zellwandmodifikationen, Zelltod, Jasmonsäure-Signalisierung und anderen verteidigungsbezogenen Gruppen. Allerdings zeigten eierbelegte Kiefern eine schwächere Reaktion des Transkriptoms auf nachfolgende Fraßschäden im Vergleich zu Kontrollbäumen ohne vorherige Eiablage. Dieses Ergebnis stellt einen bemerkenswerten Unterschied zu den bisher bekannten Reaktionen bei Angiospermen dar, bei denen das Transkriptom eierbelegter Pflanzen meist stärker oder eher auf Larval-Fraß reagierte. Möglicherweise ist die Waldkiefer bereits durch die sehr starke Transkriptomreaktion nach D. pini Eiablagen so gut auf den Larval-Fraß vorbereitet, dass bei Beginn des Larval Fraßes eine verstärkte Transkriptomreaktion für die verbesserte Verteidigung eierbelegter Kiefern gegen die Larven überflüssig wird. Einige Ergebnisse zeigten jedoch, dass Angiospermen und die hier analysierte Gymnospermen-Art auch ähnliche und somit vermutlich phylogenetisch konservierte Reaktionen auf Insekteneiablagen und Fraß zeigen. So stieg beispielsweise nach Larval-Fraß nur in eierbelegten, nicht aber in eifreien Nadeln die Salicylsäurekonzentration deutlich an, was auch in Blättern verschiedener Angiospermen beobachtet wurde. In einer dritten Studie wurde untersucht, welche Effekte der mit der Eiablage von D. pini assoziierte Elicitor der pflanzlichen Verteidigung gegen die Blattwespeneier auf die Expression von verteidigungsrelevanten Genen der Kiefer ausübt. Dazu wurde der proteinöse, Annexin-ähnliche Elicitor – genannt Diprionin – zunächst heterolog exprimiert und anschließend auf Kiefernnadeln appliziert. Diese wurden zuvor angeritzt, um damit die Verwundung bei der natürlichen Eiablage der Blattwespen nachzuahmen. Es wurden vergleichende qPCR Analysen verschiedener, potentiell verteidigungsrelevanter Gene in eierbelegten und Diprionin-behandelten Nadeln durchgeführt. Dies waren Gene, die in die Regulation von reaktiven Sauerstoffspezies und in die Kalzium-vermittelte Signaltransduktion involviert sind, sowie Gene, die für die Biosynthese verteidigungsrelevanter, phenylpropanoider und terpenoider Sekundärmetabolite wichtig sind. Diese Gene zeigten in eierbelegten und Diprionin-behandelten Nadeln ähnliche Expressionsmuster, was die Bedeutung von Diprionin für die Ei-assoziierte Abwehr von P. sylvestris unterstreicht. Pathogenese-bezogene PR Gene wurden jedoch beim Vergleich von Diprionin-behandelten und eierbelegten Kiefernnadeln unterschiedlich exprimiert, was darauf schließen lässt, dass weitere Ei-assoziierte Verbindungen und/oder Bedingungen an der Abwehrreaktion beteiligt sind. Die allgemeine Diskussion dieser Dissertation konzentriert sich auf einen Vergleich der Pheromon-bedingten und Eiablage-bedingten Abwehr- und Vorbereitungs-(Priming-)Mechanismen von Kiefern sowie auf die (Un-)Ähnlichkeiten der Abwehrreaktionen gegen verschiedene Stadien des Blattwespenbefalls. Darüber hinaus wird Diprionin im Vergleich zu anderen bekannten Insekten-assoziierten Pflanzenabwehr Elicitoren klassifiziert und versucht, mögliche Wege der Interaktion mit Pflanzengewebe zu beschreiben. Insgesamt zeigte diese Arbeit zur Interaktion von P. sylvestris und der Blattwespe D. pini, dass… … die verbesserte Verteidigung von Pheromon-exponierter Kiefer gegen Blattwespeneier mit einer verstärkten Akkumulation von Wasserstoffperoxid einhergeht … das Transkriptom der Kiefer bereits sehr stark auf die Eiablagen von D. pini reagiert und stark mit dem fraß-induzierten Transkriptom überlappt ...eierbelegte Kiefernadeln – im Gegensatz zu eierbelegten Blättern von Angiospermen – schwächer statt stärker auf Larval-Fraß reagieren …Diprionin, der mit den Eiern von D. pini assoziierte Elicitor der Verteidigung der Kiefer gegen die Eier, die Expression verschiedener verteidigungsrelevanter Gene in ähnlicher Weise induziert, wie dies auch bei der natürlichen D. pini Eiablage zu beobachten ist.
