Exploring the genetic diversity of Toxoplasma gondii in Europe by molecular fine characterization

Abstract

T. gondii is a zoonotic protozoon that can infect virtually all warm-blooded species on all continents. The parasite has a complex population structure, including countries and continents dominated by only a few clonal lineages, while T. gondii populations in South America are highly diverse. The genetic diversity described in Central and South America is associated with higher virulence and more severe cases of toxoplasmosis in humans, making it important to detect the introduction of such genotypes into Europe. This work focused on genotyping of T. gondii in Europe where the clonal lineage type II is predominant. The predominance of T. gondii type II in Europe was described in the past as part of global studies on population genetics of T. gondii, but there were no studies that focused exclusively on Europe. Therefore, the available genotyping information on European T. gondii was summarized in a review and the distribution of circulating strains in Europe was mapped, revealing that there was little or no information available for some countries. Moreover, it was recognized that the application of genotyping methods was not consistent between different laboratories. A frequently used genotyping method for T. gondii is based on MS markers. It represents the current reference standard for genotyping and fingerprinting. To reach consistency in T. gondii MS typing, a ring trial among five European laboratories was organized and the results were published together with guidelines for a harmonized application of MS typing. On this basis, MS typing results may become more comparable in the future, which is necessary to combine larger data sets on T. gondii genotypes originating from different studies. Guidelines for MS typing may also encourage more laboratories in Europe to use the MS method, which may help to fill the identified gaps in genotyping data. MS typing and WGS analysis revealed genetic variability within T. gondii type II. To explore this further, an NGS-based typing method with a high typing resolution among T. gondii type II strains was established. This new Ion AmpliSeq method appears to be suitable to improve the understanding of transmission pathways of T. gondii, to trace infection sources in outbreaks or to detect recombination and the introduction of genotypes to new areas. Furthermore, the harmonized MS method was applied in a study for genotyping of T. gondii DNA extracted from tissue samples of red squirrels (Sciurus vulgaris) found dead in the Netherlands. This study identified genetic clusters based on the MS typing results, but without obvious regional association. In future studies, cluster analyses can be performed with large, combined datasets using the harmonized MS typing method or Ion AmpliSeq typing to obtain further insights into the population structure of T. gondii in Europe.

T. gondii ist ein Protozoon, das alle warmblütigen Spezies auf allen Kontinenten infizieren kann. Der Parasit hat eine komplexe Populationsstruktur, die Kontinente umfasst, welche von wenigen klonalen Linien dominiert werden, während die T. gondii-Populationen in Südamerika vielfältig sind. Die in Mittel- und Südamerika beschriebene genetische Vielfalt wird mit höherer Virulenz und schwereren Fällen von Toxoplasmose in Verbindung gebracht, weshalb es wichtig ist, die Einschleppung solcher Genotypen nach Europa zu erkennen. Diese Arbeit konzentrierte sich auf die Genotypisierung von T. gondii in Europa, wo die klonale Linie Typ II vorherrschend ist. Die Dominanz von T. gondii Typ II in Europa wurde in der Vergangenheit im Rahmen globaler Studien zur Populationsgenetik von T. gondii beschrieben, aber es gab keine Studien, die sich ausschließlich auf Europa konzentrierten. Daher wurden die verfügbaren Informationen zur Genotypisierung von T. gondii in Europa zusammengefasst. Dabei wurde festgestellt, dass für einige Länder nur wenige oder keine Informationen verfügbar waren und, dass die Anwendung der Genotypisierungsmethoden in den verschiedenen Laboren nicht einheitlich war. Eine häufig genutzte Genotypisierungsmethode für T. gondii basiert auf Mikrosatelliten (MS)- Markern. Um eine einheitliche MS-Typisierung von T. gondii zu erreichen, wurde ein Ringversuch mit fünf europäischen Laboren durchgeführt. Die Ergebnisse wurden zusammen mit Leitlinien für die Anwendung der MS-Typisierung veröffentlicht. Das ermöglicht vergleichbare Ergebnisse und somit die Kombination größerer Datensätze zu T. gondii-Genotypen aus verschiedenen Studien. Die Leitlinien für die MS-Typisierung könnten auch mehr Labore in Europa dazu bewegen, die MS-Methode anzuwenden, was dazu beitragen könnte, die festgestellten Lücken bei den Genotypisierungs-Daten zu schließen. Die MS-Typisierung und Vollgenomanalysen zeigten bereits die genetische Variabilität innerhalb von T. gondii Typ II. Um dies weiter zu erforschen, wurde eine auf Next-Generation Sequencing basierende Typisierungsmethode mit einer hohen Typisierungsauflösung bei T. gondii Typ II-Stämmen entwickelt. Diese neue Ion AmpliSeq-Methode scheint geeignet zu sein, das Verständnis der Übertragungswege von T. gondii zu verbessern, Infektionsquellen bei Ausbrüchen zu identifizieren oder Rekombinationen und den Eintrag von Genotypen in neue Regionen zu erkennen. Darüber hinaus wurde die harmonisierte MS-Methode in einer Studie zur Genotypisierung von T. gondii-DNA aus Gewebeproben von in den Niederlanden tot aufgefundenen Eichhörnchen (Sciurus vulgaris) angewandt. Dabei konnten genetische Cluster identifiziert werden, allerdings ohne regionalen Zusammenhang. In künftigen Studien können Cluster-Analysen mit kombinierten Datensätzen mit Hilfe der harmonisierten Methoden durch MS-Typisierung oder durch Ion AmpliSeq-Typisierung durchgeführt werden, um weitere Erkenntnisse über die Populationsstruktur von T. gondii in Europa zu gewinnen.