Identifying neutrophil-related pathogenic pathways involved in NMOSD and MOGAD

Abstract

Neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD) and myelin oligodendrocyte glyco-protein antibody-associated disease (MOGAD) are rare chronic demyelinating autoimmune disorders of the central nervous system (CNS). In both conditions, neutrophils are found within CNS lesions. However, the reason for their accumulation in early NMOSD lesions remains unclear. An increase in neutrophil survival may favor their accumulation within the CNS, perpetuating a vicious cycle of tissue damage and neu-trophil activation as observed in other autoimmune conditions. The aims of this study were to evaluate whether neutrophil death is affected in AQP4+ NMOSD and MOGAD diseases and to identify serological markers involved in neutrophil death regulation compared with matched healthy controls (HC). In vitro experiments with and without PMA were performed. Additionally, serological factors were assessed in serum samples of patients and HC. The data indicates the induction of both apoptosis and NETosis following PMA stimulation. A decreased neutrophil death was found in AQP4+ NMOSD after PMA activation, compared to their HC, whilst no differences were ob-served in MOGAD. Since no alteration in NETosis was found, the hypothesis was that apoptosis was the affected cell-death mechanism in AQP4+ NMOSD neutrophils. To study potentially altered apoptotic pathways, ROS production and caspase-3 activation were evaluated. ROS production was slightly increased in AQP4+ NMOSD compared to HC, after PMA stimulation. Following PMA exposure, caspase-3 activation was decreased in both, HC and AQP4+ NMOSD, but less prominent in AQP4+ NMOSD. An increase in GM-CSF and IL-15, factors known to increase neutrophil survival through modulation of extrinsic apoptotic pathways, were found in AQP4+ NMOSD sera compared to HC. However, the exposure of HC neutrophils to AQP4+ NMOSD sera showed no increased survival, suggesting that the AQP4+ NMOSD sera is not an antiapoptotic milieu. Thus, AQP4+ NMOSD neutrophils’ resistance to death might be due to alterations of intrinsic apoptotic pathways which need to be explored. AQP4+ NMOSD patients showed a positive correlation between serum cfDNA, a non-specific neutrophil death marker increased in AQP4+ NMOSD, and neuroaxonal damage marker (NfL). We additionally found a positive association between IL-15 and cfDNA and IL-15 with NfL. In AQP4+ NMOSD patients treated with rituximab, a positive association between IL-15 and the living neutrophils rate was found. In MOGAD, none of the abovementioned alterations and correlations were found. This study points toward alterations of the neutrophil apoptotic pathway in AQP4+ NMOSD after PMA, but not in MOGAD, further supporting the notion that these two autoimmune conditions are pathogenetically different diseases. These data need to be supported by additional investigation to assess the translational relevance of our findings.

Die Neuromyelitis-optica-Spektrum-Erkrankungen (NMOSD) und die MOG-Antikörper-assoziierte Erkrankung (MOGAD) sind seltene demyelinisierende Autoimmunerkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), deren Pathogenese sich durch Akkumulation von Neutrophilen im ZNS auszeichnet. Die Ursache hierfür bleibt bisher ungeklärt. Wie auch bei anderen Autoimmunerkrankungen könnte ein verlängertes Überleben der Neutrophilen zur Akkumulation beitragen, was Gewebeschäden und Aktivierung der Neutrophilen fördert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher den Zelltod von Neutrophilen sowie serologische Marker, die den Zelltod regulieren bei AQP4+ NMOSD und bei MOGAD im Vergleich zu Gesunden zu untersuchen. Dafür wurden in vitro Experimente mit und ohne Zusatz von PMA) durchgeführt. Zusätzlich wurden serologische Marker beider Patientengruppen, sowie den gesunder Probanden analysiert. PMA induzierte sowohl Apoptose, als auch NETose. Interessanterweise wiesen Neutrophile der AQP4+ NMOSD-Patienten unter PMA-Stimulation weniger Zelltod im Vergleich zu Gesunden auf, wohingegen dies bei Neutrophilen der MOGAD-Erkrankten nicht der Fall war. Da keine Änderungen in der NETose identifiziert werden konnten, wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Apoptose den Zelltodmechanis-mus darstellt, der in AQP4+ NMOSD-Neutrophilen verändert ist. Um die möglichen Veränderungen während der Apoptose zu untersuchen, wurde dann die Produktion von ROS und die Caspase-3-Aktivierung analysiert. Im Vergleich zu gesunden Pro-banden wiesen Neutrophile der AQP4+ NMOSD-Patienten nach PMA-Stimulation ei-ne erhöhte Produktion von ROS auf. Zudem war die Caspase-3-Aktivierung der AQP4+ NMOSD-Erkrankten nach PMA-Stimulation geringer und die der Gesunden deutlich reduziert. Zusätzlich wurde ein erhöhter Spiegel von GM-CSF und IL-15, die das Überleben der Zellen durch Modulation des extrinsischen Apoptosewegs steigern, im Serum der AQP4+ NMOSD-Patienten festgestellt. Die Exposition der Neutrophilen von gesunden Probanden gegenüber dem Serum von AQP4+ NMOSD-Patienten hatte jedoch keine anti-apoptotische Wirkung. Folglich könnte die Resistenz der Neutrophilen dem Zelltod gegenüber durch Änderungen der intrinsischen Apoptosewege o.ä. zustande kommen. AQP4+ NMOSD-Patienten zeigten eine positive Korrelation zwischen cfDNA, nicht-spezifischen Zelltod-Markern und Markern der neuroaxialen Schädigung (Engl. NfL). Außerdem wurden positive Assoziationen zwischen IL-15 und cfDNA sowieIL-15 und NfL festgestellt. Bei Rituximab behandelten AQP4+ NMOSD-Patienten, wurde eine positive Korrelation zwischen IL-15 und der Rate der lebenden Neutrophilen beobachtet, was bei MOGAD nicht der Fall war. Diese Arbeit zeigt veränderte Apoptosewege der Neutrophilen nach PMA-Stimulation bei AQP4+ NMOSD im Gegensatz zur MOGAD und hebt dadurch die potenziell unter-schiedliche Pathophysiologie dieser Erkrankungen hervor. Die Ergebnisse sollten bestätigt und erweitert werden, um mögliche translationale Ansätzen zu erforschen.