dc.contributor.author
Danyel, Leon Alexander
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:56:26Z
dc.date.available
2018-03-02T09:10:38.106Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4437
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8637
dc.description.abstract
Tierexperimentelle Evidenz deutet auf protektive Effekte der pharmakologischen
Stimulation des AT2-Rezeptors des RAAS im Rahmen zerebraler und
zerebrovaskulärer Erkrankungen. Die Evaluation neuroprotektiver Effekte wird
jedoch dadurch erschwert, dass etablierte AT2-Agonisten wie CGP42112 und der
Nicht-Peptid-Agonist Compound 21 die intakte Blut-Hirn-Schranke nicht
überwinden können. Daher wird die Entwicklung neuer, ZNS-gängiger
AT2-Agonisten angestrebt. Die durch strukturelle Alteration eines
Ausgangsmoleküls gewonnenen, neuen Substanzen müssen auf ihre Affinität zum
Zielrezeptor und ihre intrinsische Aktivität geprüft werden. Das bislang
überwiegend verwendete Assay, das auf dem Auswachsen von Neuriten in vitro
basiert, ist durch einen subjektiven Auswertungsprozess und schlecht
quantifizierbare Ergebnisse benachteiligt. Ziel dieser Arbeit war die
Etablierung eines zuverlässigen, gut quantifizierbaren und automatisiert
auswertbaren in-vitro Screenings zur Prüfung der intrinsischen Aktivität
potentieller AT2-Agonisten. Grundlage des Assays bildete die Bestimmung der
Interleukin 6-Expression in THP-1-Makrophagen. Die Protein-Expression des
AT2-Rezeptors wurde zwischen THP-1-Monozyten und PMA-differenzierten
THP-1-Makrophagen mittels Western Blot verglichen. Des Weiteren wurden die
Effekte einer Inkubation von THP-1-Makrophagen mit LPS (50 ng/ml) und/oder
Compound 21 (1 µM) auf die AT2-Rezeptor-Protein-Expression untersucht. Die
intrinsische Aktivität der Substanzen JS5090, L162-389 und VR0008 am
AT2-Rezeptor wurde über die Hemmung der LPS-induzierten IL-6-mRNA-
Expressionssteigerung in THP-1-Makrophagen mittels qPCR gemessen Als
Referenzsubstanz diente der etablierte AT2-Agonist Compound 21. Die AT2
-Rezeptor-Spezifität etwaiger Effekte wurde mittels Hemmung der beobachteten
Effekte durch den AT2-Antagonisten PD123319 sichergestellt. Die PMA-abhängige
Differenzierung von THP-1-Monozyten zu -Makrophagen führte zu einer
Verzehnfachung der AT2-Rezeptor-Protein-Expression im Western Blot
(Einzelexperiment, p = 0,0002). Sowohl die direkte AT2-Rezeptor-Stimulation,
als auch die LPS-Inkubation von THP-1-Makrophagen induzierten eine
signifikante Absenkung der AT2-Rezeptor-Expression (Einzelexperiment, p =
0,0001; bzw. p = 0,0008). JS5090, L162-389, VR0008 und Compound 21 konnten
keine reproduzierbare, signifikante Beeinflussung der LPS-induzierten IL-6
-mRNA-Expressionssteigerung in THP-1-Makrophagen bewirken. Die Substanzen
JS5090, L162-389 und VR0008 konnten nicht als AT2-Agonisten verifiziert
werden. Ferner zeigte die Referenzsubstanz Compound 21 keine konsistente
Beeinflussung der LPS-induzierten IL-6-mRNA-Expression. Die Validität des
verwendeten Assays wird somit am ehesten durch die interexperimentelle
Heterogenität der Effekte der PMA-abhängigen Differenzierung von
THP-1-Monozyten und der LPS-Stimulation von THP-1-Makrophagen eingeschränkt.
Zukünftige Protokolle sollten daher mit dem Ziel optimiert werden, eine
kontrollierte und interexperimentell konsistente PMA-abhängige
Differenzierungen der THP-1-Monozyten zu gewährleisten. Aktuell ist das
IL-6-THP-1-Assay als Screening-Verfahren für potentielle AT2-Rezeptor-
Agonisten ungeeignet.
de
dc.description.abstract
Accumulating evidence suggests tissue-protective properties of pharmacological
AT2R-stimulation in various animal models of cerebral and cerebrovascular
disease. Further investigation of the neuroprotective properties of
pharmacological AT2R-stimulation is hindered, because common AT2R-agonists
like CGP42112 and the non-peptide agonist Compound 21 cannot penetrate the
blood-brain barrier. Therefore, a new generation of blood-brain barrier-
penetrating AT2R-agonists is being developed. New substances, designed through
chemical alteration of established molecules, need to be reevaluated for
AT2R–affinity and intrinsic activity. Common assays available, e. g. the
Neurite-Outgrowth-assay are considered to be unreliable on the grounds of
subjective analysis and imprecise quantification of results. Therefore, this
project aimed at establishing a reliable and robust in vitro screening of
potential AT2R–agonists for intrinsic activity at the AT2R based on
determining interleukin 6 (IL-6) mRNA expression in THP-1-macrophages. AT2R-
protein expression in THP-1-monocytes was compared with AT2R-protein
expression in PMA-differentiated THP-1-macrophages using Western-Blot
analysis. Effects of LPS- (50 ng/ml) and Compound 21- (1 µM) incubation on
AT2R-protein-expression in THP-1-macrophages were evaluated. THP-1-macrophages
were incubated with LPS (50 ng/ml), co-treated with the novel agents JS5090,
L162-389 and VR0008 (1 µM each) for 6 hours and IL-6-mRNA expression
determined by qPCR. AT2R-agonist Compound 21 was used for reference. AT2R-
agonism was postulated if the substance in question attenuated the increase of
LPS-induced IL-6-mRNA expression. The AT2R -antagonist PD123319 (10 µM) was
used to confirm AT2R -specificity of observed effects. PMA-induced
differentiation of THP-1 monocytes to macrophages increased expression of the
AT2R-receptor-protein tenfold in Western Blot analysis (single experiment, p =
0,0002). Incubation with LPS and Compound 21 each significantly decreased
AT2R-receptor-protein-expression (single experiment, p = 0,0001 and p = 0,0008
respectively). Treatment of THP-1 macrophages with JS5090, L162-389, VR0008,
or Compound 21 did not result in consistent, significant effects on LPS-
induced IL-6-mRNA-expression. JS5090, L162-389 and VR0008 could not be
verified as AT2R-receptor agonists. Since the established AT2R-Agonist
Compound 21 also did not elicit consistent effects on LPS-induced IL-6-mRNA-
expression in our assay, we conclude that the tested assay was of limited
validity probably due to unpredictable effects of PMA-induced differentiation
and LPS-incubation of THP-1-macrophages. Future protocols should be optimized
to achieve controlled and inter-experimentally consistent PMA-induced
differentiation of THP-1-monocytes. In conclusion, the current
IL-6-THP-1-assay has to be regarded as not suitable for the screening of
potential AT2R-receptor agonists.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Angiotensin II Type 2 receptor
dc.subject
Angiotensin II
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Untersuchung der intrinsischen Aktivität potentieller AT2-Rezeptor Agonisten
in differenzierten THP-1-Makrophagen
dc.contributor.firstReferee
N. N.
dc.contributor.furtherReferee
N. N.
dc.date.accepted
2018-03-02
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000106337-6
dc.title.translated
In vitro screening for intrinsic activity of potential AT2R–agonists in
differentiated THP-1-macrophages
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000106337
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000023143
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access