Investigation of Presynaptic Plasticity Mechanisms at the Hippocampal Mossy Fiber Bouton

Abstract

Hippocampal mossy fiber boutons are giant plastic synapses, connecting dentate gyrus granule cells to CA3 pyramidal cells. They play a crucial role in mnemonic processes, especially during the encoding and consolidation of declarative memory, and are also implicated in neurodegenerative diseases. Upon increased granule cell activity, mossy fiber boutons are able to drive postsynaptic pyramidal cells through enhanced neurotransmission over short and long timescales, creating sparse but strong inputs into the highly recurrent CA3 network. Despite decades of research, detailed knowledge regarding various forms of mossy fiber plasticity is still lacking. In contrast to many other synapses, the long-term strengthening of the mossy fiber synapse is induced and expressed presynaptically. It depends on a calcium-calmodulin dependent increase in presynaptic cAMP levels and results in sustained enhancement of transmitter release. This presynaptic potentiation can be induced via the chemical adenylyl cyclase activator forskolin. However, the complete cascade underlying presynaptic long-term potentiation is not yet clarified. To dissect the molecular mechanisms underlying presynaptic potentiation, I investigated the possible involvement of three presynaptic molecules in mossy fiber plasticity: voltage-gated calcium channels, Munc13-1 and synapsin. I aimed to measure the coupling distance between voltage-gated calcium channels and vesicle release sites in potentiated and non-potentiated mossy fiber boutons. The coupling distance is crucially influencing the peak Ca2+ concentration at the release site and thereby the release probability. A shortening of this distance could support enhancement of transmission upon presynaptic potentiation. By combining immunohistochemistry in thin acute mouse brain slices with three-color super-resolution STED microscopy, I measured the distance between the release site marker Munc13-1 and voltage-gated calcium channels of family Cav2 at the mossy fiber bouton. I found that the average coupling distance between Munc13-1 and Cav2 channels was unchanged after chemical potentiation. These results indicate that presynaptic potentiation is not accompanied by a tightening in the coupling distance. While distances measured between Munc13-1 and the Cav2.1-containing and Cav2.2-containing calcium channels were in line with predicted loose coupling at the mossy fiber bouton, the Cav2.3-containing channel was significantly closer to release sites. This peculiar location could indicate special functions of this calcium channel type at the mossy fiber bouton. To test whether an increase in release sites might underlie presynaptic potentiation I examined a possible increase in Munc13-1 intensity in stratum lucidum after chemical potentiation. By analyzing fluorescence intensities in confocal image stacks of mouse brain cryosections, I compared the Munc13-1 content in potentiated versus non-potentiated mossy fibers. I found that the mean fluorescence was unchanged after two different incubation times with forskolin, indicating that there is no net change in the Munc13-1 content in potentiated mossy fibers. Within the hippocampus, I found reduced Munc13-1 intensities in area CA3a compared to area CA3c. This gradient of Munc13-1 expression along the proximal-distal axis of CA3 might suggest differential connectivity within these subregions. Finally, we scrutinized the role of synapsins in mossy fiber transmission and plasticity. We were especially interested in the role of synapsin III due to its peculiar expression in adult mossy fiber boutons. Mossy fiber field recordings in a mouse model lacking all synapsin isoforms revealed changes in excitability and presynaptic plasticity compared to wildtype mice. To take into consideration the onset of epileptic seizures in this mouse model, we compared two age groups: one before and one after the onset of epileptic seizures. We found increased excitability and synaptic depression, while frequency facilitation and post-tetanic potentiation were reduced in both age groups of knockout animals. These alterations likely can be attributed to structural changes in mossy fiber vesicle pools following the deletion of synapsins. Long-term potentiation was increased in presymptomatic knockout animals, while it was unchanged in the older age group compared to wildtype mice. Here, one could speculate that specificly the loss of synapsin III might lead to increased long-term potentiation. The onset of epileptic seizures could subsequently lead to network changes that compensate for the increased long-term potentiation observed in presymptomatic animals. In summary, the results of my thesis indicate that mossy fiber presynaptic long-term potentiation is not accompanied by major changes in the distance between calcium sources and release sites. Additionally, I found unchanged Munc13 1 content in mossy fibers after potentiation, indicating that potential changes in release site numbers are mediated by existing Munc13-1 supplies rather than local translation. Finally, elevated release during long-term potentiation might be regulated by synapsin III, as indicated from experiments in mice lacking all synapsins. These findings contribute to a better understanding of mossy fiber presynaptic plasticity. They open up new research questions regarding the mechanisms underlying the astonishing properties of hippocampal mossy fiber boutons. Resolving these mechanisms will help to understand the function of this synapse within the hippocampal circuitry and thereby also in mnemonic processes in health and disease.

Hippokampale Moosfaser Boutons sind große, plastische Synapsen, die Körnerzellen aus dem Gyrus dentatus mit CA3 Pyramidenzellen verbinden. Sie spielen eine substanzielle Rolle in Gedächtnisprozessen, insbesondere in der Bildung und Konsolidierung von deklarativen Gedächtnisinhalten. Weiterhin sind sie in neurodegenerativen Erkrankungen involviert. Moosfaser-synapsen sind im Stande, auf präsynaptische Aktivitätsanstiege mit erhöhter Neurotransmission zu reagieren und so ihre postsynaptischen Partner über kurze und lange Zeiträume zu aktivieren. Dadurch nehmen sie einen sporadischen, aber starken Einfluss auf das in sich hochgradig verschaltete CA3 Netzwerk. Trotz jahrzehntelanger Forschung mangelt es noch immer an detailliertem Wissen zu den verschiedenen präsynaptischen Plastizitätsformen an der Moosfasersynapse. Im Gegensatz zu vielen anderen Synapsen wird die langanhaltende Stärkung hier präsynaptisch induziert und exprimiert. Die Stärkung beruht auf einem Kalzium-Calmodulin abhängigen Anstieg in der präsynaptischen cAMP Konzentration, welcher in einer langanhaltenden Erhöhung von Transmitterfreisetzung resultiert. Dieser Anstieg kann chemisch durch den Adenylylzyklase-Aktivator Forskolin induziert werden. Jedoch ist die genaue Kaskade für Moosfaser Langzeitpotenzierung noch nicht abschließend geklärt. Um die molekularen Mechanismen präsynaptischer Potenzierung besser zu verstehen, habe ich die mögliche Beteiligung dreier Moleküle in der Moosfasersynapse untersucht: spannungsabhängige Kalziumkanäle, Munc13-1 und Synapsine. Es war mein Ziel, die Kopplungsdistanz zwischen spannungsabhängigen Kalziumkanälen und vesikulären Freisetzungsstellen in potenzierten Moosfasersynapsen zu messen. Diese Distanz nimmt maßgeblichen Einfluss auf die Spitzenkonzentration von Kalziumionen an der Freisetzungsstelle und damit auf die Freisetzungswahrscheinlichkeit. Eine Verkürzung der Kopplungsdistanz zwischen Kalziumkanälen und Kalziumsensoren könnte somit zu einer erhöhten Transmitterfreisetzung führen. Die Kombination aus Immunhistochemie in akuten Gewebeschnitten und hochauflösender, dreifarbiger STED Mikroskopie hat es mir ermöglicht, die Distanz zwischen Munc13-1 – einem Marker für Freisetzungsstellen – und spannungsabhängen Cav2 Kalziumkanälen an der Moosfasersynapse zu messen. Die Messungen ergaben, dass sich die durchschnittliche Kopplungsdistanz nach Potenzierung nicht verändert und suggerieren somit, dass die präsynaptische Potenzierung an dieser Synapse nicht von einer Verkürzung der Kopplungsdistanz begleitet wird. Während die gemessenen Distanzen zwischen Munc13-1 und den Cav2.1 und Cav2.2 Kalziumkanälen mit einer losen Kopplungsdistanz an der Moosfasersynapse übereinstimmten, befand sich der Cav2.3 Kanal signifikant näher an den Freisetzungsstellen. Diese besondere Positionierung könnte spezielle Funktionen dieses Kanaltyps an der Moosfasersynapse andeuten. Um zu untersuchen, ob präsynaptische Plastizität an der Moosfasersynapse von einem Anstieg in der Zahl der Freisetzungsstellen begleitet sein könnte, habe ich eine mögliche Intensivierung der Munc13-1 immunhistochemischen Färbung nach chemischer Potenzierung geprüft. Durch die Analyse von Fluoreszenzintensitäten in konfokalen Bildstapeln aus kryostatischen Gehirnschnitten konnte ich den Munc13-1 Inhalt in potenzierten und nicht-potenzierten Moosfasern vergleichen. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität war unverändert nach zwei verschiedenen Inkubationszeiten mit Forskolin. Dies lässt vermuten, dass keine Nettoänderung von Munc13-1 in potenzierten Moosfasern auftritt. Innerhalb des Hippokampus‘ konnte ich reduzierte Munc13-1 Intensitäten in der CA3a Region im Vergleich mit CA3c beobachten. Solch ein Gradient in der Munc13-1 Expression innerhalb der proximal-distalen Achse von CA3 deutet verschiedene Konnektivitäten innerhalb von CA3 Subregionen an. Schließlich haben wir die Rolle von Synapsinen in Moosfasertransmission und –plastizität studiert. Durch die auffällige Expression in adulten Moosfasersynapsen waren wir besonders an der Rolle von Synapsin III interessiert. Feldmessungen haben offenbart, dass sich in Mäusen ohne Synapsine sowohl die Erregbarkeit als auch die präsynaptische Plastizität der Moosfasersynapse von wildtypischen Mäusen unterscheidet. Um die altersbedingte Entwicklung des epileptischen Phänotyps in der Knockout-Maus nicht außer Acht zu lassen, haben wir zwei verschiedene Altersgruppen verglichen: Eine vor und eine nach Beginn der epileptischen Anfälle. In den Knockout-Tieren konnten wir einen Anstieg in der Erregbarkeit und der synaptischen Depression beobachten, während Frequenzfazilitation und post-tetanische Potenzierung in beiden Altersgruppen reduziert waren. Diese Änderungen resultieren vermutlich aus strukturellen Abweichungen in Vesikelspeichern nach der Deletion von Synapsinen. Langzeitpotenzierung war in jungen Knockout-Tieren erhöht, während sie in älteren Tieren unverändert blieb. Man könnte spekulieren, dass speziell der Verlust von Synapsin III zu der erhöhten Langzeitpotenzierung führt. Anschließend könnte der altersbedingte Ausbruch von Epilepsie zu Netzwerkveränderungen beitragen, die die erhöhte Langzeitpotenzierung in präsymptomatischen Tieren kompensieren. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse meiner Dissertation an, dass Moosfaser Langzeitpotenzierung nicht mit größeren Veränderungen in der Kopplungsdistanz zwischen Kalziumkanälen und Freisetzungsstellen einhergeht. Außerdem weisen unveränderte Munc13-1 Inhalte nach der Moosfaserpotenzierung darauf hin, dass eventuelle Veränderungen in der Anzahl von Freisetzungsstellen vermutlich durch bereits existierende Munc13-1 Vorräte gespeist werden und keine lokale Proteintranslation nötig ist. Schließlich könnte der verstärkte Anstieg in Transmitterfreisetzung während der Langzeitpotenzierung in Synapsin-Knockout-Moosfasern auf eine Rolle für Synapsin III als Freisetzungsregulator hindeuten. Diese Befunde tragen zu einem besseren Verständnis von präsynaptischer Moosfaserplastizität bei und eröffnen neue Fragestellungen bezüglich der Mechanismen, die den erstaunlichen Eigenschaften dieser Synapse zugrunde liegen. Ein tiefergehendes Verständnis dieser Mechanismen wird dabei helfen, die spezifische Funktion der Moosfasersynapse im hippokampalen Schaltkreis sowie in Gedächtnisprozessen und neurodegenerativen Erkrankungen besser zu verstehen.