Investigation on the contribution of the human TRPV3 channel to the transport of NH4+ in keratinocytes of human skin

Abstract

Involvement of TRPV3 mutants in Olmsted syndrome is well-documented, yet the precise mechanisms underlying their pathogenicity remain elusive, particularly concerning trafficking and functionality within the cell membrane with controversial hypotheses in literature. Furthermore, and despite reports suggesting a role in NH4+ uptake in ruminant species, the permeability of the TRPV3 channel to this ion remained uncertain. This study aims to elucidate the NH4+ permeability of human and bovine TRPV3 channels using Xenopus laevis oocytes and HEK-293 cells, with a primary focus on the human channel. Immunoblotting and immunostaining confirm the expression and trafficking of TRPV3 channels in both models as well as in native tissue. Notably, human skin equivalents and bovine rumen both showed distinct staining of the apical membrane of the top layer of keratinocytes with weaker cytosolic staining in the middle layers, suggesting potential roles in epithelial function. Functional assays, including single-channel patch clamp experiments and whole-cell studies with agonists, demonstrate the channels' responsiveness and permeability to NH4+ showing larger conductances in TRPV3 overexpressing cells. Furthermore, pH-sensitive microelectrodes were used to measure acidification by NH4+ in Xenopus laevis oocytes showing endogenous channels capable of NH4+ transport while also demonstrating significantly greater effects in TRPV3 expressing cells. These observations challenge conventional dogmas regarding membrane transport primarily via NH3 diffusion. Expression of the TRPV3 mutant G573S in HEK-293 cells elucidates its impact on cell viability, with significant cell death observed and partial rescue via treatment with the established blocker ruthenium red. Crucially, immunofluorescence validated cytosolic expression, with membrane staining detected in a minority of cells. These observations argue for the hypothesis of a functional expression in the membrane where the gain-of-function mutation triggers the cascade ending in increased cell death. Our study highlights the versatility of TRPV3 channels not only in Ca2+ signaling as extensively described in the literature, but also more generally as a cation transporter including for NH4+, with implications for various biological processes including skin physiology, ion homeostasis, pH regulation, and nitrogen utilization. These insights contribute to our evolving understanding of the biological role of TRPV3 and hold potential for informing future research and clinical interventions.

Die Beteiligung von TRPV3-Mutanten am Olmsted-Syndrom ist gut dokumentiert. Dennoch bleiben die genauen Mechanismen ihrer Pathogenität unklar. Insbesondere der Einbau und die Funktionalität innerhalb der Zellmembran werden in der Literatur kontrovers diskutiert. Trotz Berichten über eine Rolle beim NH4+-Transport beim Wiederkäuer bleibt ferner die Durchlässigkeit des TRPV3 Kanals für dieses Ion ungewiss. Diese Arbeit zielt darauf ab, die NH4+-Permeabilität von menschlichen und bovinen TRPV3-Kanälen zu klären. Dabei wurden Xenopus laevis Oozyten und HEK-293-Zellen als Modelsystem verwendet und der Schwerpunkt lag auf dem menschlichen Kanal. Immunoblotting und Immunfärbungen bestätigen die Expression und den Einbau von TRPV3-Kanälen in beiden Modellen sowie in nativem Gewebe. Menschliche Hautäquivalente und boviner Pansen zeigten eine deutliche Färbung der apikalen Membran der obersten Schicht der Keratinozyten mit schwächerer zytoplasmatischer Färbung in den mittleren Schichten. Dies weist darauf hin, dass der TRPV3 Kanal eine wichtige Rolle im Epithel spielen könnte. Funktionelle Untersuchungen mit Patch-clamp- und Whole-cell Experimenten zeigen eindeutig die Permeabilität der Kanäle für NH4+ mit größerer Leitfähigkeit in überexprimierenden Zellen. Darüber hinaus wurden pH-sensible Mikroelektroden verwendet, um die Ansäuerung durch NH4+ in Xenopus laevis Oozyten zu messen. Dabei konnten endogene Kanäle beobachtet werden, die eindeutig NH4+ transportierten. Dies stellt traditionelle Dogmen bezüglich des Membrantransportes in Frage, welche hauptsächlich in Form von NH3-Diffusion erfolgen soll. Zusätzlich konnten signifikant größere Effekte in überexprimierenden Zellen beobachtet werden, was die NH4+-Leitfähigkeit von TRPV3 erneut aufzeigt. Eine Expression der TRPV3-Mutante G573S in HEK 293-Zellen verdeutlichte die toxischen Auswirkungen der gain-of-function-Mutante auf die Überlebensrate der Zellen, wobei nach Behandlung mit dem etablierten Blocker Ruthenium Rot eine Erhöhung der Zellvitalität beobachtet werden konnte. Zusätzlich konnte mittels Immunfluoreszenz die zytoplasmatische Expression und bei einer geringen Zahl an Zellen sogar eine Färbung der Mutante in der Membran dokumentiert werden. Diese Beobachtungen unterstützen somit eher die Hypothese einer funktionellen Expression in der Membran, in der die gain-of-function-Mutation den Kettenprozess auslöst, der zu vermehrtem Zelltod führt. Während der TRPV3-Kanals bisher in der Literatur hauptsächlich im Rahmen seiner Rolle bei der Ca2+-abhängigen Signaltransduktion untersucht wurde, beleuchtet unsere Studie seine Vielseitigkeit. Demnach könnte der TRPV3 ganz allgemein eine Rolle als Kationentransporter spielen, darunter auch für das NH4+-Ion, mit Auswirkungen auf verschiedene biologische Prozesse in der Hautphysiologie, des Ionenhaushalts, der pH-Regulierung und der Stickstoffnutzung. Diese Erkenntnisse tragen zu unserem sich stetig entwickelnden Verständnis der biologischen Rolle des TRPV3 bei und bieten Potenzial für zukünftige Forschung und klinische Interventionen.