dc.contributor.author
Sharbati-Tehrani, Soroush
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:01:31Z
dc.date.available
2005-06-03T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/442
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-4645
dc.description
Titel, Inhaltsverzeichnis
1 Introduction 1
1.1 Mycobacteria are distinguished by their growth characteristics 1
1.2 The extremely hydrophobic mycobacterial OM is penetrated by porins 3
1.3 Many slow-growing mycobacteria cause severe diseases 4
1.4 Pathogenic rapidly growing mycobacteria 5
1.5 Environmental persistence of mycobacteria 6
1.6 Goals of this study 7
2 Materials and Methods 9
2.1 Strains and growth conditions 9
2.2 Cell lines and culture conditions 10
2.3 Molecular biology techniques 10
2.4 In silico analysis 10
2.5 Isolation of genomic DNA from mycobacteria 11
2.6 Protein preparation and Western blot 11
2.7 M. bovis BCG experiments 12
2.8 RGM experiments 15
2.9 Construction of the suicide plasmid pSSs003 21
3 Results 23
3.1 Heterologous expression of the porin MspA from M. smegmatis in M. bovis
BCG affects its in vitro growth and intracellular persistence. 23
3.2 Porins limit the intracellular persistence of M. smegmatis 30
3.3 Characterization of porins from members of the M. fortuitum-group 38
3.4 Construction of the suicide plasmid pSSs003 49
4 Discussion 52
5 Summary 61
6 Zusammenfassung 63
7 References 65
8 Appendix 77
8.1 Abbreviations 77
8.2 Maps of plasmids 78
8.3 Nucleotide sequences 83
8.4 Publications resulted from this study 89
8.5 Acknowledgements 90
8.6 Erklärung 91
dc.description.abstract
The genus Mycobacterium comprises highly pathogenic as well as opportunistic
or apathogenic species exhibiting a great variability with respect to their
growth rates but also their ability to persist or multiply on the cellular
level. Intracellular persistence is a key feature of virulence of M.
tuberculosis, the causative agent of human tuberculosis. The intention of this
work was to find out whether or to which degree the permeability of the
mycobacterial outer membrane affects the intracellular persistence. For this
purpose the major porin of M. smegmatis (mspA), which is lacking in slow-
growing mycobacteria, was expressed in M. bovis BCG. Quantification of
bacterial growth on agar plates demonstrated clearly increased growth of the
M. bovis BCG derivative expressing MspA. Transposon mutagenesis proved the
mspA gene to be responsible for the growth enhancement. Intracellular
multiplication of the M. bovis BCG derivative in the mouse macrophage cell
line J774A.1 and the human pneumocyte cell line A549 was also clearly
enhanced.
In contrast to this finding, deletion of mspA in M. smegmatis increased its
intracellular persistence in A. castellanii and murine bone marrow
macrophages. Deletion of mspA together with another homologous porin mspC in
another mutant strain of M. smegmatis resulted in decreased growth in broth
culture while it significantly enhanced intracellular persistence in murine
bone marrow macrophages, the mouse macrophage cell line J774A.1 and A.
castellanii, respectively. Complementation of deletions by expression of mspA
in the porin mutant strains resulted in restoration of the wild type phenotype
with respect to intracellular persistence.
These data show that the permeability of the mycobacterial cell wall affects
the intracellular persistence. These findings also suggest that intracellular
persistence of mycobacteria depends, inter alia, on the balance between
"walling-off" towards the hostile environment and the uptake of required
compounds in the nutrient-depleted phagosomal environment.
Furthermore, the gene porM1 encoding a porin homologous to MspA was
characterized in M. fortuitum. PorM1 was present in different strains of M.
fortuitum and in the closely related non-pathogenic M. peregrinum. Analysis of
expression patterns of porM1 showed divergent expression profiles among the
members of the M. fortuitum-group. Due to the ability of M. fortuitum to
persist and due to the existence of porins like PorM1, this species represents
an appropriate model to study the impact of mycobacterial porins on
persistence.
de
dc.description.abstract
Die Gattung Mycobacterium beherbergt sowohl hoch pathogene als auch
opportunistische oder apathogene Arten, die unterschiedliche Wachstumsraten
aufweisen und sich außerdem in der Fähigkeit intrazellulär zu persistieren
unterscheiden. Ein Hauptmerkmal der Virulenz von M. tuberculosis, dem Erreger
der Tuberkulose im Menschen, ist die intrazelluläre Persistenz. Das Ziel
dieser Arbeit war herauszufinden, ob und inwiefern die Permeabilität der
äußeren Membran von Mykobakterien die intrazelluläre Persistenz beeinflusst.
Hierfür wurde das Porin MspA von M. smegmatis, welches in langsam wachsenden
Mykobakterien nicht vorkommt, in M. bovis BCG expremiert. Die Quantifizierung
des bakteriellen Wachstums auf Agarplatten zeigte einen deutlichen
Wachstumsvorteil des M. bovis BCG Derivats, das mspA enthielt. Die Mutagenese
von mspA mittels einer Transposon-Insertion zeigte, dass MspA den veränderten
Phänotyp bedingte. Des Weiteren zeigte das M. bovis BCG Derivat mit MspA eine
verbesserte intrazelluläre Persistenz in der murinen Makrophagen-Zelllinie
J774A.1 und der humanen Lungenepithel-Zelllinie A549.
Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen führte die Deletion von mspA in M.
smegmatis zu einer verbesserten intrazellulären Persistenz in A. castellanii
und in murinen Knochenmarksmakrophagen. Die Deletion von mspA und dem
homologen Poringen mspC in einem anderen Mutantenstamm von M. smegmatis führte
zu langsamerem Wachstum in Flüssigkultur und verbesserter intrazellulärer
Persistenz in der murinen Makrophagen-Zelllinie J774A.1, in A. castellanii und
in murinen Knochenmarksmakrophagen. Die Komplementation der Mutation durch die
Expression von mspA in den Mutantenstämmen führte zur Wiederherstellung des
Wildtyp-Phänotyps.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Permeabilität der mykobakteriellen Zellwand
die intrazelluläre Persistenz und die Wachstumsrate beeinflusst. Außerdem
deuten diese Daten daraufhin, dass die Persistenz von Mykobakterien abhängig
ist von der Balance zwischen der Abschottung gegenüber dem feindlichen
phagosomalen Milieu und der Aufnahme von benötigten Nährstoffen in dieser
nährstoffarmen Umgebung.
Weiterhin wurde das Gen porM1von M. fortuitum charakterisiert, das ein
homologes Porin zu MspA kodiert. PorM1 konnte in allen untersuchten Stämmen
von M. fortuitum und in zwei Stämmen der nahe verwandten und apathogenen Art
M. peregrinum nachgewiesen werden. Die Expressionsanalyse von porM1 zeigte
unterschiedliche Expressionsmuster innerhalb der untersuchten Stämme der M.
fortuitum-Gruppe. Aufgrund der Fähigkeit von M. fortuitum intrazellulär
persistieren zu können und aufgrund des Vorhandenseins von Porinen wie PorM1,
stellt diese Art ein geeignetes Modell dar, um den Einfluss mykobakterieller
Porine auf die Persistenz zu studieren.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
outer membrane
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Impact of mycobacterial porins on growth and intracellular persistence
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Bernd Appel
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2005-05-27
dc.date.embargoEnd
2005-06-15
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2005001421
dc.title.translated
Einfluss mykobakterieller Porine auf Wachstum und intrazelluläre Persistenz
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001573
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2005/142/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001573
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open access