Messung zellulärer Immunantworten im Rahmen der prophylaktischen Impfung gegen Humane Papillomviren

Abstract

HPV-assoziierte benigne und maligne Neoplasien stellen weltweit ein häufiges Gesundheitsproblem dar. Ungefähr 70% aller invasiven Zervixkarzinome werden initial durch eine Infektion mit den High-Risk-HPV-Typen 16 und 18 verursacht und ca. 90% aller anogenitalen Condylome durch HPV 6 und 11 ausgelöst. Die prophylaktische Impfung mit der virus-like particle-basierten, quadrivalenten Vakzine Gardasil® verhindert bei vorher HPV-naiven Frauen sicher eine Infektion mit den genannten vier HPV-Typen über mindestens fünf Jahre. Auf humoraler Ebene konnte im Rahmen der Zulassungsstudien eine starke Immunogenität belegt werden. Gardasil®-induzierte Antikörpertiter erlangen ein Vielfaches der im Vergleich zu nach natürlichen Infektionen gemessenen Antikörperkonzentrationen, fallen jedoch einige Monate nach Abschluss des Impfzyklus ab. Bisher erfolgte kein direkter Nachweis HPV-Vakzin-spezifischer T-Zellen. Impfantigen-spezifische CD4+ T-Helfer-Zellen spielen jedoch eine wichtige Rolle für die B-Zellaktivierung sowie den Antikörperklassenwechsel und stellen in Form von T-Gedächtniszellen eine wichtige Komponente anamnestischer Immunantworten dar, die mit großer Wahrscheinlichkeit für die Langzeitwirkung eines Impfstoffes mitverantwortlich sind. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, eine verlässliche Methode zur ex vivo Darstellung HPV- Antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen in Vollblutproben zu entwickeln. Für eine Querschnittsstudie wurden 63 Probandinnen verschiedenen Impfstatus rekrutiert. Die Probandinnen der einfach geimpften Gruppe wurden zudem als integrierte Longitudinalstudie über den gesamten weiteren Impfzyklus verfolgt. Mittels eines Fragebogens konnte gezeigt werden, dass die Probandinnen der verschiedenen Studiengruppen bezüglich des Alters, immunologischer Auffälligkeiten, gynäkologischer Anamnese und des Sexualverhaltens eine hohe Homogenität aufwiesen. Die Vollblutproben der Probandinnen wurden mit HPV L1-Peptidpools der jeweils vier in der Vakzine enthaltenen HPV-Typen sowie weiteren Kontrollantigenen über 12 bis 24 Stunden ex vivo stimuliert. Nach entsprechender Aufbereitung konnten Antigen-spezifische T-Helfer-Zellen mittels einer intrazellulären CD4 / CD154 / IL-2 / INF-γ-Färbung identifiziert und durchflusszytometrisch dargestellt werden. Parallel erfolgte mit Hilfe eines serologischen Multiplex-Assays eine Messung HPV L1-spezifischer Antikörper in Plasmaproben des gleichen Kollektivs. Der ex vivo Nachweis von HPV L1-spezifischen CD4+ T-Zellen gelang bei den geimpften Probandinnen der Querschnittsstudie. Einfach geimpfte Studienteilnehmerinnen zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant mehr spezifische T-Zellen, die zweite Impfung führte sogar zu einem hochsignifikanten Anstieg der HPV L1-spezifischen T-Zellantwort. Probandinnen mit zwei und drei Gardasil®-Impfungen zeigten hingegen in der quantitativen Ausprägung der Vakzin-spezifischen T-Zellantwort keinen signifikanten Unterschied. Unabhängig vom Impfstatus ließen sich für die Low-Risk-HPV-Typen 6 und 11 hochsignifikant mehr L1-spezifische T-Zellen nachweisen als für HPV 16 und 18. Die virus-like particles des High-Risk-Vertreters HPV 18 induzierten mit Abstand am wenigsten L1-spezifische CD4+ T-Zellen. Seitens der Antikörper konnte bei den geimpften Probandinnen der Studie eine Serokonversion gezeigt werden. Im Gegensatz zum Verlauf der zellulären Immunantwort zeigten die HPV L1-spezifischen Antikörper einen Anstieg über den gesamten Impfverlauf. Bei Probandinnen, die bereits drei Dosen der Vakzine erhalten hatten, ließen sich signifikant mehr HPV L1-spezifische Antikörper messen als bei nur zweifach geimpften Studienteilnehmerinnen. Die virus-like particles des häufigen High-Risk- Vertreters HPV 16 induzierten unabhängig vom Impfstatus am meisten L1-spezifische Antikörper, die Antikörperantwort auf HPV 6 und 11 war aber nur geringfügig schwächer ausgeprägt. Wie bereits auf Ebene der T-Zellen schnitt HPV 18 mit einem hochsignifikant niedrigeren L1-spezifischen Antikörpertiter am schlechtesten ab. HPV L1-spezifische IL-2+ T-Helfer-Zellen und Antikörper zeigten keine direkte Korrelation. Die Longitudinalstudie bestätigte die beschriebenen Ergebnisse. Auch im Rahmen des Follow-ups der elf Studienteilnehmerinnen zeigte sich, dass durch die dritte Gardasil®-Impfung insgesamt kein signifikanter Anstieg der spezifischen CD4+ T-Zellen erfolgt. Des Weiteren konnte erneut belegt werden, dass die Low-Risk-spezifische T-Zellantwort im Vergleich zur HPV 16- und vor allem HPV 18-spezifischen CD4+ T-Zellantwort stärker ausgeprägt ist. Im Rahmen dieser Arbeit gelang erstmals der direkte Nachweis HPV L1-spezifischer IL-2+ T-Helfer-Zellen sowie INF-γ+ TH1-Zellen nach prophylaktischer HPV-Impfung. Die Größenordnung ließ sich im Vergleich zu zellulären Immunantworten auf andere Impfstoffe als realistisch einschätzen. Trotzdem die dritte Impfung im Gardasil®-Impfschema auf zellulärer Ebene keinen Vorteil erbrachte, kann ohne weitere Forschung nach der momentanen Datenlage hinsichtlich humoraler Immunantwort und Effektivität in Verhinderung von HPV-assoziierten Läsionen nicht auf diese verzichtet werden. Die stärkere zelluläre Immunogenität der Low-Risk-HPV-Typen 6 und 11 kann durch einen möglichen Boost einer bereits früher im Leben erworbenen Low- Risk-Infektion oder aber durch eine Kreuzreaktivität der beiden HPV-Typen untereinander erklärt werden. Das schlechte Abschneiden von HPV 18 sowohl auf zellulärer als auch auf humoraler Ebene sollte Anlass geben, die Vakzine im weiteren Verlauf auf ihre Wirksamkeit gegen HPV 18-Infektionen zu reevaluieren. Auf Grund der insgesamt kleinen Fallzahlen der durchgeführten Studien sollte ein T-Zell-Monitoring an einem größeren Kollektiv erfolgen. Um den Nachweis von T-Gedächtniszellen abzusichern, ist es zudem nötig, IL-2+ HPV L1-spezifische T-Zellen mehrere Jahre nach der letzten erhaltenen Impfdosis darzustellen. Zusätzlich zur bereits erbrachten Charakterisierung der INF-γ+ TH1-Antwort sollte eine IL-4-Färbung zur Charakterisierung der Vakzin- spezifischen TH2-Antwort etabliert werden. Des Weiteren ist es nun möglich, mit der etablierten Methode auch HPV L1-spezifische T-Zellen nach Impfung mit der zweiten HPV-Vakzine Cervarix® vergleichend darzustellen. Ein weiteres mögliches Forschungsziel auf diesem Gebiet könnte die Detektion von kreuzreaktiven T-Zellen sein, um die prophylaktischen HPV-Impfstoffe in ihrem gesamten Wirkungsspektrum besser einschätzen zu können.

The virus-like particle (VLP)-based quadrivalent vaccine Gardasil® provides prophylactic protection against infections with the human papillomavirus types 6, 11, 16 and 18. Since September 2006 it is available on the European market and was widely accepted. Serological data from the large phase III clinical trials describe antibody levels above those of natural infections, though antibody concentrations decrease in the first years after vaccination. T helper responses in particular are important for memory, recall and anamnestic responses. Only very few reports on cellular immune responses to the prophylactic HPV vaccine are available to date. We present data from a cross sectional study including 63 subjects distinguished by their vaccination status as well as the results of a confirmatory longitudinal study following up 10 young women during the course of vaccination. We applied a feasible ex vivo test to monitor HPV antigen-specific CD4 T cells from whole blood. One ml of blood was stimulated with different HPV-L1 peptide pools for 16 hours. Antigen specific memory CD4 T cells were identified by intracellular staining for CD4, CD154, IL-2 and IFN-γ and analysed by flow cytometry. Blood plasma was analysed for the presence of antibodies to capsid protein L1 of a broad variety of HPV types by multiplexed human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione S-transferase fusion proteins. Memory T Helper cell responses can be detected already after the first injection, increase after the second, but not after the third vaccination. Low-risk HPV VLP induce higher specific T cell frequencies than high-risk HPV VLP. Both the cross sectional and the longitudinal study showed consistent results.