Untersuchung der pulmonalen Genexpression auf Einzelzellebene in der (Pneumokokken)-Pneumonie

Abstract

Hintergrund: Die Lunge ist ein mikroanatomisch komplexes Organ, in dem über 40 verschiedene Zellpopulationen zu dem Erhalt der physiologischen Organfunktion bei-tragen. Während einer akuten bakteriellen Infektion wie der ambulant erworbenen Pneumonie (engl.: community acquired pneumonia, CAP) migrieren weitere Leukozytenpopulationen in die Lunge. Die bakterielle CAP stellt sowohl in Europa als auch weltweit eine häufige und potenziell letale Erkrankung dar, was ein besseres Verständnis der Pathophysiologie mit allen beteiligten Zelltypen erstrebenswert macht. In dieser Arbeit sollte ein Protokoll etabliert und validiert werden, das Einzelzell-Transkriptomanalysen im infektiologischen Kontext ermöglicht, sowie erhaltene Datensätze exploratorisch analysiert werden. Methodik: Drei Zellisolationsprotokolle wurden evaluiert, um Einzelzell-Suspensionen mit hoher Viabilität und Singularität aus murinem Lungengewebe von mit Streptococcus pneumoniae Serotyp 2 (S. pn), der Pneumolysin-defizienten Pneumokokken-Mutante (S. pn Δply) oder mit Lösungsmittel (Kontrollgruppe) infizierten Versuchstieren zu isolieren. Nachfolgend wurde eine magnetische Zell-Aufreinigung durchgeführt, Genexpressionsbibliotheken erstellt und diese sequenziert. Die Datenauswertung erfolgte durch Software des Herstellers sowie R und entsprechende Pakete. Ergebnisse: Das erhaltene Transkriptom von 10.933 Zellen konnte Leukozyten, Epithelzellen, Endothelzellen und mesenchymalen Zellen zugeordnet werden, eine übermäßige Expression an Stressgenen wurde vermieden. Fibroblasten zeigten eine starke Reaktion durch die Regulation der Gene Lcn2 und Gsn nach Infektion mit S. pn. Makrophagen exprimierten nach Infektion, in Abhängigkeit vom Virulenzfaktor Pneumolysin, ein Muster an Genen des Interferon-Signalwegs. Granulozyten zeigten insbesondere eine Cxcl2 Hochregulierung sowie eine verminderte Expression von Ccl3, Cxcl3 und Il1rn durch Pneumolysin. Schließlich war die Anzahl an Zell-Interaktionen verschiedener Zelltypen durch inflammatorische Geschehnisse reduziert. Schlussfolgerung: Die Möglichkeit, unterschiedliche Zellpopulationen auf Einzelzell-ebene zu untersuchen, erweitert insbesondere in der Lunge als heterogenem Organ das Verständnis von pathophysiologischen Geschehnissen. Wenn die Ergebnisse mit anderen Methoden vergleichbarer Auflösung wie der Proteomik, Sekretom-Analysen oder Spatial transcriptomics validiert werden, kann dies den Weg zu neuen Therapieansätzen ebnen.

Background: The lung is a micro-anatomically complex organ harboring more than 40 different cell populations essential for maintaining physiological organ function. During an acute bacterial infection, such as community acquired pneumonia (CAP), leukocyte populations migrate to the lung further expanding the cellular landscape. Bacterial CAP is a common and potentially lethal disease both in Europe and worldwide, and therefore a better understanding of the pathophysiology and cell types involved is crucial. The aim of this study was to establish and validate a protocol that is applicable for single-cell transcriptome analysis in infectious disease research and to perform exploratory analysis on the generated data sets. Methods: Three cell isolation protocols were evaluated to ensure technical and qualitative requirements of isolating single cell suspensions with high viability and singularity using murine lung tissue. Mice were infected with Streptococcus pneumoniae serotype 2 (S. pn), the pneumolysin-deficient pneumococcal mutant (S. pn Δply) or solvent (control group), followed by magnetic cell sorting, gene expression library construction and sequencing. Data analysis was performed using the manufacturer’s software and R, including add-on packages for single-cell analysis. Results: The resulting transcriptome of 10,933 cells could be assigned to leukocytes, epithelial cells, endothelial cells, and mesenchymal cells while excessive expression of stress genes was avoided. Fibroblasts showed a strong response to infection with S. pn through regulation of the genes Lcn2 and Gsn. Macrophages expressed a pattern of interferon pathway genes after infection, dependent on the presence of the virulence factor pneumolysin. Granulocytes exhibited upregulation of Cxcl2 and downregulation of Ccl3, Cxcl3 and Il1rn by pneumolysin. Finally, the number of cell-cell interactions of different origin was reduced by inflammatory events. Conclusion: The possibility of studying different cell populations at a single-cell level may contribute to a better understanding of pulmonary pathophysiological events, especially considering the very heterogeneous nature of the lungs. Thus, single-cell RNA-sequencing could pave the way to new therapeutic approaches, particularly if results are validated with other methods of comparable resolution such as proteomics, secretomics or spatial transcriptomics.