Identifikation und Validierung von endogenen Referenzgenen für Genexpressionsanalysen des Prostata- und Harnblasenkarzinoms mit Hilfe der quantitativen Echtzeit-RT-PCR

Abstract

Für Genexpressionsstudien, die mittels der RT-PCR durchgeführt werden, werden geeignete Referenzgene zur relativen Quantifizierung von Zielgenen benötigt. Bis zum heutigen Zeitpunkt wurde der Eignung von Housekeeping-Genen für Expressionsstudien im Prostata- und Harnblasenkrebsgewebe nur unzureichend Rechnung getragen. Die Zielsetzung dieser Arbeit war es deshalb, geeignete Referenzgene aus einer Auswahl von 16 Kandidatengenen für die relative Quantifizierung bei Genexpressionsstudien auszuwählen. In gepaarten mikrodissezierten malignen und nichtmalignen Prostataproben, die von 17 unbehandelten Patienten mit einem Prostatakarzinom nach radikaler Prostatektomie gewonnen wurden, wurde mittels RT-PCR die mRNA-Expression der Gene ACTB, ALAS1, ALB, B2M, G6PD, GAPD, HMBS, HPRT1, K-ALPHA-1, POLR2A, PPIA, RPL13A, SDHA, TBP, UBC und YWHAZ untersucht. Für die Suche nach geeigneten Referenzgenen beim Harnblasenkarzinom wurden an gepaarten malignen und nichtmalignen Gewebeproben, die von 14 Patienten mit einem Harnblasenkarzinom stammten, die Genexpression der neun Gene ACTB, ALAS1, G6PD, GAPD, HMBS, HPRT1, K-ALPHA-1, SDHA und TBP ermittelt. Nach der RNA-Isolierung und der RNA- Integritätskontrolle mit dem Agilent-2100-Bioanalyzer, wurden die Echtzeit-RT- PCRs mit dem ABI-Prism-7700 Sequence-Detection-System bzw. dem Roche- LightCycler®-Instrument durchgeführt. Es wurden nur solche RNA-Proben verwendet, die einen hohen Reinheitsgrad und eine hohe Integrität besaßen. Die untersuchten Gene lagen in einem breiten Expressionsbereich mit PCR-Zyklen zwischen 16 und 37 für die Prostata bzw. 20 und 34 Zyklen für die Harnblase. Bei der Prostata unterschieden sich die Expressionshöhen nicht signifikant (P>0,05) von pT2- und pT3-Tumorproben bzw. von Proben mit einem Gleason-Grad <3 und >4 und von Proben mit Gleason-Scores (Gleason-Gesamtpunktzahl) <7 und >7. Für die Harnblase konnten ebenfalls keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich Geschlecht und Tumorstadium festgestellt werden. Zwischen den gepaarten malignen und nichtmalignen Prostatagewebeproben zeigten die Gene ACTB, RPL13A und HMBS signifikante Unterschiede (t-Test, P<0,02) in ihren Expressionshöhen. Für Harnblasengewebeproben betraf dies die Gene GAPD, G6PD und HMBS (P<0,04). Bei den anderen untersuchten Genen bestanden keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Die Computerprogramme geNorm, NormFinder und BestKeeper sowie der Äquivalenztest wurden verwendet, um die am besten geeigneten Bezugsgene zu identifizieren. Für die Prostata errechneten alle Computermethoden HPRT1, ALAS1, SDHA und K-ALPHA-1 als die stabilsten Gene. Diese Gene umfassen einen ausgedehnten Expressionsbereich. Als Quantifizierungsbeispiel wurde die Expression der Zielgene RECK und PCA3, normalisiert mit der HPRT1 als Einzelgen und mit den Normalisierungsfaktoren aus der Kombination von zwei oder drei Referenzgenen sowie mit den regulierten, instabilen Genen ACTB und RPL13A, dargestellt. Bei der relativen Quantifizierung der Gene RECK und PCA3 wurde verdeutlicht, wie wichtig der Gebrauch geeigneter Referenzgene ist, um fehlerhafte Normalisierungen an Zielgenen in Prostata-Genexpressionsstudien zu vermeiden. In der hier vorliegenden Studie genügte für eine korrekte Normalisierung der Gebrauch des Einzelgens HPRT1. Jedoch sind Normalisierungen mit zwei Genen (HPRT1 und ALAS1) oder allen drei Genen (HPRT1, ALAS1 und K-ALPHA-1) zu empfehlen, um eine höhere Zuverlässigkeit der Daten zu erreichen. Im Harnblasengewebe wurden die Gene SDHA, TBP und ACTB als die stabilsten Gene für eine relative Quantifizierung ermittelt. Sie repräsentieren höhere und niedrigere Expressionsniveaus. Für eine praktische und zuverlässige Normalisierung von Zielgenen sollte in Harnblasenkarzinomstudien ein Normalisierungsfaktor, der aus den Referenzgenen SDHA und TBP besteht, verwendet werden.

Using quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), reference genes are utilized as endogenous controls for relative quantification of target genes in gene profiling studies. The suitability of housekeeping genes for that purpose in prostate cancer and bladder cancer tissue has not been sufficiently investigated so far. The objective of this study was to select from a panel of 16 potential candidate reference genes the most stable genes for gene normalization. Expression of mRNA encoding ACTB, ALAS1, ALB, B2M, G6PD, GAPD, HMBS, HPRT1, K-ALPHA-1, POLR2A, PPIA, RPL13A, SDHA, TBP, UBC and YWHAZ was examined in matched microdissected malignant and nonmalignant tissue specimens obtained from 17 no treated prostate carcinomas after radical prostatectomy by real-time RT-PCR. Expression profiles of the nine genes ACTB, ALAS1, G6PD, GAPD, HMBS, HPRT1, K-ALPHA-1, SDHA and TBP were established in matched malignant and nonmalignant tissue specimens obtained from 14 patients with urinary bladder cancer. After the RNA isolation and its integrity assessment with the Agilent 2100 Bioanalyzer, real-time RT-PCR were performed with the ABI Prism® 7700 Sequence Detection System and with the Roche LightCycler® instrument. Only such RNA samples were used, which possessed a high degree of purity and a high integrity. The genes studied displayed a wide expression range with cycle threshold values between 16 and 37 for the Prostate, and 20 and 34 for the urinary Bladder. For prostate, the expression was not different (P>0.05) between samples from pT2 and pT3 tumors or between samples with a Gleason score <3 and >4 and between samples with a Gleason total score <7 and >7. For Bladder the expression did not depend on patient sex and tumor stage and grade. ACTB, RPL13A, and HMBS showed significant differences (at least P<0.02) in expression between malignant and nonmalignant prostate pairs. GAPD, G6PD, and HMBS showed significant differences (at least P<0.04) in expression between malignant and nonmalignant bladder pairs. Expression of the remaining genes did not differ between the matched pairs. The software programs geNorm, NormFinder, BestKeeper as well as the Equivalence test were used to identify the most suitable reference genes. For Prostate, HPRT1, ALAS1, SDHA and K-ALPHA-1 were calculated by all methods to be the most stable genes covering a broad range of expression. As quantification example, the expression of the target genes RECK and PCA3 normalized with HRPT1 as single gene and with the normalization factors generated by the combination of two or three reference genes as well as with the unstable genes ACTB or RPL13 is given. These examples showing the significance to use suitable reference genes to avoid erroneous normalizations in gene profiling studies for prostate cancer. In this study, the use of the single gene HPRT1 as reference gene was sufficient for a correct normalization. However, normalization factors generated from two genes (HPRT1 and ALAS1) or all three genes (HPRT1, ALAS1 and K-ALPHA-1) are recommended for an improved reliability of normalization data. SDHA, TBP and ACTB were the most stably expressed genes in bladder cancer tissue, covering higher and lower expression levels. For practical and reliable normalization of target genes in gene profiling studies of bladder cancer, a normalization factor generated from the two housekeeping genes SDHA and TBP should be used.