Charakterisierung der Photoisomerisierung in Bakteriorhodopsin durch Femtosekunden-Infrarot-Schwingungsspektroskopie

Abstract

Die Dynamik der Schwingungsbanden der all-trans- nach 13-cis-Isomerisierung des Retinalchromophors in Bakteriorhodopsin (bR) wird erstmals in dem gesamten Spektralbereich von 940 bis 1800 cm-1 mittels eines neu aufgebauten Femtosekunden-Anregungs-Abtast-Absorptionsspektrometers zeitlich aufgelöst. Die durchstimmbaren und breitbandigen Infrarot(IR)-Abtastpulse werden in einem Aufbau erzeugt, der aus einem zweistufigen, optisch parametrischen Verstärker und einer Differenzfrequenzmischung besteht. Zusammen mit den durchstimmbaren, sichtbaren und 100 fs-langen Anregungspulsen erhält man eine Systemantwort von ca. 200 fs (FWHM).

Das Membranprotein Bakteriorhodopsin enthält einen Retinalchromophor, der durch die Photoanregung der all-trans-Konfiguration in die 13-cis- Konfiguration isomerisiert. Die Isomerisierung um die C13=C14-Bindung wird am Schwingungsspektrum der vom pi-Elektronensystem entkoppelten C-C-Bindungen am eindeutigsten nachgewiesen. Bisher konnte dieser Prozess auf struktureller Ebene nicht zeitaufgelöst verfolgt werden.

Es werden die spektralen Bereiche, in denen die spezifischen C-C-Streckschwingungen (1150 bis 1250 cm-1), die spezifischen C=C-Streckschwingungen (1500 bis 1540 cm-1) und die C=NH-Streckschwingung (1600 bis 1640 cm-1) absorbieren, untersucht und diskutiert. Das zentrale Ergebnis ist, dass bei 1195 cm-1 die für die 13-cis-Konfiguration charakteristische C-C-Streckschwingungsbande mit einer Zeitkonstante von 450 fs entsteht. Im Spektralbereich der C=C-Streckschwingungen wird die Entstehung des J-Zustands bei 1511 cm-1 ebenfalls mit 500 fs und dessen Zerfall mit 3 ps bestimmt. Die Signale um 1620 cm-1 zeigen die aufgrund der Isomerisierung veränderte Umgebung der Schiffschen Base an. Durch die gleiche Zeitkonstante von ~ 0,5 ps für die Entstehung der 13-cis-Konfiguration und des elektronischen Grundzustands und für den S1-Zerfall ergibt sich, dass diese Prozesse simultan ablaufen. In allen drei Spektralbereichen sind die all- trans-Schwingungsbanden (1200 cm-1; 1529 cm-1; 1640 cm-1) instantan als negative Banden (Bleichbanden) vorhanden und zeigen mit einer Zeitkonstante von 1 bis 2 ps eine deutlich langsamere Wiederentstehung als der S1-Zerfall. Als Erklärung für diesen Prozess wird die Abkühlung von heißen Schwingungsübergängen im elektronischen Grundzustand vorgeschlagen. Sie erfordert im Reaktionsmodell die Einführung eines Zustands BR* im elektronischen Grundzustand zwischen S1 und BR570. Dem BR*-Zustand werden die heißen Schwingungsbanden von bR-Molekülen mit all-trans-Konfiguration zugeordnet. Die heißen Banden mit dem 13-cis-Chromophor gehören zum J-Zustand.

Durch das Protein bR5.12, das einen sterisch geblockten Retinalchromophor enthält, wird eine Zuordnung für die spektrale Lage (1570 cm-1) der C=C-Streckschwingung im S1-Zustand für das native bR getroffen. Der S1-Zerfall von bR5.12 und der Rückgang in den elektronisch Grundzustand werden global mit 17 ps bestimmt. In den Bereichen der Peptidgerüstabsorption (1550 und 1660 cm-1) wird eine Proteinreaktion mit der Zeitkonstante von 2 ps beobachtet, die ihre Ursache ausschließlich in der elektronischen Anregung des Chromophors hat.

For the first time the dynamic of the vibrational bands in the spectral range between 940 and 1800 cm-1 of the retinal chromophore in bacteriorhodopsin (bR) is time resolved by a new femtosecond (fs) pump probe absorption spectrometer. The probe pulse is generated in a 2-stage optical parametric amplifier with a difference frequency generation. The tunable mid infrared (MIR) probe pulses und the tunable visible pump pulses yield a system response of 200 fs (FWHM).

Light causes a rotation around the C13=C14 bound of the retinal chromophore of the membrane protein bacteriorhodopsin. This all-trans to 13-cis isomerization is provided by the characteristic vibrational modes weakly coupling to the pi- electron system of the chromophore. Up to now the formation of the corresponding 13-cis absorption band pattern could not resolve precisely by femtosecond vibrational spectroscopy.

In this work the patterns of the difference spectra of the ranges between 1150 and 1200 cm-1 (C-C stretch modes), around 1530 cm-1 (C=C stretch modes), and from 1600 to 1640 cm-1 (C=NH stretch mode) are well investigated und used as indicators for isomerization, intermediate state and protonation state of the retinal. The main result is that the characteristic absorption band for 13-cis configuration at 1195 cm-1 increase by a time constant of 450 fs. Also the typical J intermediate band at 1511 cm-1 shows an increase of 500 fs and a decrease of 3 ps. The conclusion is that the time constants for the 13-cis formation, the decay of the electronic excited state and the appearance of new electronic ground state absorption are similarly: these processes run simultaneously and originate from the same minimum on the excited electronic potential surface (S1).

Over all spectral ranges the negative all-trans vibrational bands increase instantly and decline at a significant slower time constant (1-2 ps) than the decrease time of the electronic excited state. This time constant corresponds to the cooling process of vibrational hot bands in the electronic ground state. In an enhanced reaction scheme the hot state BR* is established which is characterized by bR molecules with hot all-trans retinal bands and the common intermediate state J with hot 13-cis retinal bands.

The protein bR5.12 contains a stericly blocked chromophore, therefore no isomerization can take place. This protein is adapted to analyze the S1 decay. The S1 absorption band is found at 1570 cm-1 and shows a main decay time of 17 ps. A second time constant is found for the spectral ranges of the peptide backbone absorption; this could be understood as an induced effect of the electronic excitation.