Circadian Rhythms and microRNAs in Energy Metabolism

Abstract

Circadian clock and metabolic systems are intertwined at the molecular and genetic level to adapt energy utilization to geophysical time. Disruption of clockwork genes has been associated to metabolic and cellular malfunction; however, the exact molecular makeup of this relationship in glucose and lipid metabolism is still unclear. The potential relevance of microRNAs in this interplay is also largely unexplored. Here, the role of the heterodimeric transactivator duo Clock-Bmal1 – a core constituent of the peripheral circadian machinery – was investigated in pancreatic beta cells and liver along with its relation to metabolic microRNAs based on three subprojects: i) Firstly, mice deficient for either Clock or Bmal1 in pancreatic beta cells displayed glucose intolerance and diminished insulin release. The core circadian components were indispensable for appropriate vesicle exocytosis, but not for the early stages of glucose-stimulated insulin secretion. Clock- deficient beta cells displayed an abnormally elevated exocytotic rate, underscored by a regulation in numerous components of the exocytotic machinery. Collectively, the data suggested that Clock-Bmal1 promote insulin release through an action on membrane fusion dynamics and that disruption of the heterodimeric duo in beta cells represents a predisposing cause for type 2 diabetes. ii) Secondly, it was found that clock is posttranscriptionally suppressed by the highest expressed microRNA in pancreatic beta cells, mir-375, which is a negative regulator of insulin secretion. mir-375 overexpression evoked downregulation of Clock in vitro, whereas loss of mir-375 induced Clock upregulation in pancreatic islets in vivo. Thus, clock was delineated as one target, mediating the negative impact of mir-375 on insulin secretion. Moreover, mir-375-/- islets displayed an enhanced intrinsic capacity to sustain circadian rhythms in the absence of external entrainment cues ex vivo. This suggested that mir-375 attenuated intercellular coupling in the functional syncytium of the islet pacemaker. iii) Thirdly, in respect to liver function, Clock-deficiency resulted in impaired lipoprotein secretion. Clock-Bmal1 was demonstrated to physically interact with a conserved intronic E-box response element in ppargc1b driving expression of the transcriptional coactivator Pgc-1b and thereby promoting expression of downstream metabolic factors, involved in lipogenesis and lipoprotein assembly. Furthermore, a metabolic microRNA was found to be a Clock-Bmal1 target: Intronic mir-378 was co-transcribed with its host ppargc1b in an oscillating manner, yet, expression of its mature sequence remained constant over time. Collectively, the results established a molecular nexus between Clock-Bmal1 function and hepatic lipoprotein metabolism. In sum, the current work shed light on the molecular basis for Clock-Bmal1 action in two aspects of energy metabolism – insulin secretion and lipoprotein production. It further provided information on Clock-Bmal1 interconnection with mir-375 in beta cells and mir-378 in hepatocytes.

Die circadiane Uhr und metabolische Systeme sind auf molekularer Ebene verbunden, um Energienutzung an die geophysikalische Zeit anzupassen. Fehlfunktion von Uhrwerkgenen ist mit metabolischen und zellulären Defekten assoziiert; jedoch sind die präzisen Mechanismen dieser Verbindung in Bezug auf Glukose- und Lipidmetabolismus noch unklar. Eine mögliche Relevanz von microRNAs in diesem Zusammenspiel ist auch weitgehend unerforscht. Hier wurde die Rolle des heterodimeren Transaktivators Clock-Bmal1 – ein Kernelement des circadianen Uhrwerks – in pankreatischen Betazellen und Leber untersucht, sowie dessen potentielles Zusammenspiel mit microRNAs, anhand der folgenden drei Subprojekten: i) Erstens, Mäuse defizient für Clock oder Bmal1 in pankreatischen Betazellen wiesen defekte Glukosetoleranz und Insulinsekretion auf. Die circadianen Kernkomponenten waren unabdingbar für den normalen Ablauf der Vesikel-Exozytose, jedoch nicht für die frühen Phasen des glukose- stimulierten Signaltransduktionswegs. Clock-defiziente Betazellen zeigten eine erhöhte Exozytoserate und veränderte Genexpression vieler Komponenten des Exozytose-Apparats. Insgesamt deuteten die Ergebnisse darauf hin, dass der circadiane Transaktivator die Membranfusion der Insulinvesikel kontrolliert und dass die gestörte Clock-Bmal1 Funktion in Betazellen ein begünstigender Faktor für die Entwicklung von Diabetes Typ 2 darstellt. ii) Zweitens, in pankreatischen Betazellen wurde nachgewiesen, dass clock durch die höchst exprimierte microRNA mir-375, die Insulinsekretion negativ reguliert, posttranskriptional supprimiert wird. mir-375 Überexpression bewirkte eine Herunterregulation von Clock in vitro, während mir-375 Deletion eine Hochregulation von Clock in Langerhans Inseln in vivo auslöste. Dementsprechend wurde clock als ein Zielgen von mir-375 ermittelt, welches zu der negativen Wirkung dieser microRNA auf Insulinsekretion beiträgt. Des Weiteren zeigten mir-375-/- Langerhans Inseln eine verbesserte Eigenschaft, autonome circadiane Rhythmen in der Abwesenheit von externen Zeitgebern ex vivo aufrechtzuerhalten. Dies deutete darauf hin, dass mir-375 die interzelluläre Kopplung des funktionellen Syncytiumm der Betazelluhr schwächt. iii) Drittens, hinsichtlich Leberfunktion resultierte Clock-Defizienz in defekter Lipoproteinsekretion. Clock-Bmal1 bindete nachweislich an ein konserviertes E-box Element in ppargc1b, um die Expression des Transkriptionscoaktivators Pgc-1b anzutreiben, und somit die Expression von metabolischen Genen, involviert in Lipid- und Lipoproteinsynthese, zu begünstigen. Weiterhin wurde gezeigt, dass eine metabolische microRNA durch Clock-Bmal1 aktiviert wird. Die intronische mir-378 wurde zusammen mit ppargc1b oszillierend transkribiert, wobei die Expression der reifen mir-378 konstant blieb. Insgesamt haben die Ergebnisse die Verbindung zwischen Clock- Bmal1 und Lipoproteinmetabolismus in der Leber aufgeklärt. Zusammenfassend hat diese Arbeit die molekularen Mechanismen der Funktion von Clock-Bmal1 hinsichtlich zwei metabolische Aspekte – Insulinsekretion und Lipoproteinsynthese –erläutert. Des Weiteren hat sie zu der Aufklärung des Zusammenspiels zwischen Clock-Bmal1 und mir-375 in Betazellen sowie mir-378 in der Leber beigetragen.