Entwicklung der segmentalen Innervation im peripheren Nervensystem beim Vertebraten

Abstract

Die molekularen und zellbiologischen Mechanismen der axonalen Wegfindung beschäftigt die Neurowissenschaft schon seit Jahrzehnten. Ausgehend von den Spinalganglien und deren Neuriten entwickelt sich die periphere sensible Hautinnervation, die in der segmentalen Dermatomkartierung zum Ausdruck kommt. Dieses Muster findet sich durchgehend im Vertebraten und Evertebraten, weshalb es für die Untersuchung molekularer Wegfindungsmechanismen ein anschauliches Modell bietet. Auch im zentralen Nervensystem (ZNS) liefert die Entstehung des Gyrus dentatus ein einfaches Modell zur Untersuchung axonaler Wegfindungsmechanismen. Es ist bereits bekannt, dass drei unterschiedliche Substanzklassen bei der axonalen Wegfindung eine wichtige Rolle spielen. Neurotrophine wie BDNF, NGF und NT-3 sind für das Überleben von verschiedenen Neuronenpopulationen unerlässlich. Darüber hinaus bewirken sie das Auswachsen und bestimmen die Auswachslänge der verschiedenen sensorischen Axone. Wegfindungsmoleküle wie u.a. Semaphorine, Ephrine, Netrine, Slits und RGMs sind Moleküle, die rezeptorvermittelt die Auswachsrichtung der Axone steuern. Sie können sekretiert oder membranständig sein. Als dritte Substanzklasse haben extrazelluläre Matrixmoleküle wie u. a. Kollagene, Laminine oder Proteoglykane einen wichtigen Stellenwert bei der axonalen Wegfindung. Um die Mechanismen bei der Entstehung der peripheren Innervation weiter zu verfolgen, untersuchten wir das Auswachsverhalten von Axonen sensibler Spinalganglien am Rattenmodell in der Zellkultur. Hierfür wurden thorakale Spinalganglien von Ratten am Embryonaltag 13 in einer Kollagenmatrix in einem geringen Abstand zueinander kokultiviert. Diese wurden dann mit verschiedenen Neurotrophinen stimuliert, womit das Auswachsen unterschiedlicher Axonenpopulationen hervorgerufen wird. Axone NGF stimulierter einander gegenüberliegender Ganglien zeigten ein deutliches repulsives Verhalten gegeneinander, wodurch sich ein freier angrenzender Bereich bildete. Im Gegensatz hierzu war unter NT-3 Stimulation ein Ineinanderwachsen der Axone zu beobachten. Um den Einfluss extrazellulärer Matrixmoleküle auf den repulsiven Effekt zu verifizieren, führten wir die Kokulturen auf unterschiedlichen Oberflächen durch. Hierbei konnte die Repulsion lediglich auf einer Lamininoberfläche mit NGF- Stimulation beobachtet werden. Weiterführende Experimente mit cDNA Mikroarrays und Real-Time PCRs mit bekannten Guidancemolekülen von NGF- und NT-3 stimulierten Ganglien führten zu möglichen Kandidaten, die für die Repulsion verantwortlich sein könnten. Anschließende Versuche mit funktionellen Antikörpern gegen diese bereits bekannten sekretierten Wegfindungsmoleküle konnten die repulsiven Effekte jedoch nicht blockieren. Unsere Daten führen zu der Annahme, dass der von uns beobachtete Effekt von einem noch unbekannten Molekül gesteuert wird, das von den nozizeptiven Axonen selbst sekretiert zu werden scheint. Des Weiteren scheint dieses Molekül mit dem extrazellulären Matrixmolekül Laminin zu interagieren. Wir nehmen an, dass es von Laminin gebunden wird, was erklären würde, dass es auf dieser Oberfläche seine Wirkung nicht verliert.

The molecular mechanisms underlying axonal pathfinding are still poorly understood. Skin sensory dermatomes are arranged as segmental areas that originate from dorsal root ganglia (DRGs) and their outgrowing peripheral spinal nerves. This segmental pattern provides a simple model to investigate the molecular mechanisms of axonal pathfinding in the peripheral nervous system. Likewise, the development of the dentate gyrus provides a practical model to investigate the molecular mechanisms in the central nervous system. Generally, neurotrophins, guidance molecules and extracellular matrix molecules are known to play a pivotal role in axonal guidance during development. Neurotrophins like nerve growth factor (NGF) are essential for the survival of nociceptive neurons and support the extension of their neurites. Axons are guided to their targets by a combination of diffusible and membrane- bound guidance molecules having either an attractive or a repulsive effect on the growth cone. Some of the best characterized chemorepellants are the semaphorins, ephrins and netrins. Furthermore, extracellular matrix molecules like laminin play an important role by interacting with guidance molecules to establish gradients or influence the sensitivity of the growth cones directly. To investigate the guidance mechanisms and molecular cues involved in sensory dermatome patterning, we placed DRGs in close vicinity to each other and used different neurotrophins to stimulate DRG axonal outgrowth and discovered an NGF- but not NT3- dependant repulsion between outgrowing neurites of the ganglia in a 3- dimensional collagen coculture system. This effect was not observed on a collagen culture surface, but on a laminin culture surface. We performed cDNA microarrays and realtime- PCR analysis for known guidance molecules to generate candidates that may have caused the repulsion. Functional antibodies against several of those cues could not block the repulsion, which suggests the presence of an unknown factor that seems to interact with laminin responsible for our observation.