dc.contributor.author
Üstünel, Murat
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:53:45Z
dc.date.available
2015-03-19T11:32:14.458Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4401
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8601
dc.description.abstract
Bivalente meso-4,5-Diaryl-2-imidazolin Dihydrochloride unter anderem mit den
Substitutionsmustern 2-Halo-4-hydroxy, 4-Hydroxy und 4-Fluor am Aromaten
wurden synthetisiert. Hierbei wurden Alkylspacer der Kettenlänge n = 4-10
gewählt. Nach einer modifizierten Synthese nach Vögtle und Goldschmitt wurden
die entsprechend substituierten meso-1,2-Diarylethylendiamine erhalten und
diese mit Diiminodiethylester Dihydrochloriden verschiedener Kettenlänge (n =
4-10) zu den entsprechenden bivalenten meso-4,5-Diaryl-2-imidazolin
Dihydrochloride umgesetzt. Außerdem konnte das Monomer
meso-4,5-Bis(2,6-dichlor-4-hydroxyphenyl)-2-imidazolin Hydrochlorid
synthetisiert werden. 2-Halo-4-hydroxy substituierte Verbindungen wurden auf
ihre Zytotoxizität und Affinität zum ERalpha und beta untersucht. Die
Substanzen mit einer 2-Fluor-4-hydroxy-Substitution zeigten keine
zytotoxischen oder am ER agonistischen/antagonistischen Eigenschaften. Alle
bivalenten 2-Chlor-4-hydroxy-2-imidazolin Dihydrochloride wirkten nicht
wachstumshemmend auf hormonabhängige MCF-7 Mammakarzinom-Zellen. An
U2OS/alpha- und U2OS/beta-Zellen konnte gezeigt werden, dass Dimere analog
ihren Monomeren keine bessere Affinität zum ERalpha beziehungsweise beta
hatten. Nur das C4-Analogon war in der Lage, die Luciferase-Expression zu
aktivieren. Eine Antiestrogenität wurde nicht beobachtet. Interessanterweise
hatten diese dimeren Verbindungen Einfluss auf die ERalpha- Dichte in MCF-7-
Zellen. Das C4-Analogon stimulierte die Dichte. Bei einer Konzentration von 1
und 10 µM konnten aber die weiteren Verbindungen die Rezeptordichte um knapp
65 % verringern. Keine dieser Testverbindungen zeigte eine Bindungsaffinität
zu den ER-Subtypen. Einzig das 2,6-Dichlor-4-hydroxy substituierte Monomer
zeigte eine beachtliche Wirksamkeit an U2OS-Zellen. Bei 3.88•10-9 bzw.
4.7•10-10 M an beiden Subtypen konnte eine 50 %ige Luciferase-Expression
bezogen auf den natürlichen Liganden 17beta-Estradiol festgestellt werden.
Damit war diese Verbindung der in dieser Arbeit erhaltene stärkste Agonist an
beiden ER-Subtypen. Dimere mit 4-Hydroxy-Substituenten am Aromaten sind
inaktiv. Eine antiproliferative Wirkung an MCF-7- Zellen konnte auch bei einer
Konzentration von über 20 µM nicht beobachtet werden. Durch das Fehlen von
Halogensubstituenten in ortho-Stellung verlieren sie ihre Affinität zum
ERalpha beziehungsweise ERbeta. Mit 4-Fluor substituierte Dimere wurden auf
ihre Zytotoxizität und Zellaufnahme an hormonabhängigen MCF-7 Mammakarzinom-
Zellen untersucht. Diese wirken stark zytotoxisch. Ihre IC50-Werte liegen im
oberen nanomolaren Bereich [IC50: 60 (630 nM) > 61 (430 nM) > 62 (260 nM) > 63
(240 nM)]. Mit steigender Kettenlänge nimmt dieser Effekt zu. Er korreliert
mit einer sehr starken zellulären Anreicherung. Das monomere 2-Imidazolin mit
der Fluor-Substitution in para- Position am Aromaten dagegen ist weder
zytotoxisch noch wird es ausgeprägt in der Zelle angereichert. Verfolgt wurden
die zelluläre Anreicherung mit einer neu entwickelten Methode, der High-
Resolution Continuum Source Atomabsorptionsspektroskopie. Ein
Anreicherungsgrad von 219 kann bei 61 nach 60 Minuten Inkubation der Zellen
mit 2 µM beobachtet werden. Mit steigender Kettenlänge nimmt die Zellaufnahme
dieser Verbindungen weiter zu. Bei gleicher Inkubationszeit und Konzentration
erhöht sie sich bei 62 bereits auf einen Anreicherungsgrad von 275. 63 zeigt
sogar bereits nach 40 Minuten einen Anreicherungsgrad auf 412. Allerdings
konnte nicht mehr geklärt werden, ob die hohen Anreicherungsgrade
intrazellulärer Natur sind oder ob sie sich auf der Zelloberfläche anreichern.
Da kein pharmakologisches Testsystem für den membranständigen GPR30-Rezeptor
vorhanden war, konnte seine Beteiligung an der Zellaufnahme nicht nachgewiesen
werden. Einen möglichen Hinweis auf intrazelluläre Anreicherung lieferten aber
Untersuchungen mit Zellaufnahmehemmern. Nur in Anwesenheit von Methyl-beta-
Cyclodextrin (M-beta-CD) konnte eine starke Verringerung der Zellaufnahme der
untersuchten C10-Verbindung beobachtet werden. Die intrazelluläre
Fluorkonzentration konnte bis fast auf die Hälfte des Kontrollwertes auf 56 %
reduziert werden. Der Einfluss des M-beta-CD deutet womöglich auf eine
Caveolin vermittelte Endozytose der Verbindungen hin. Einige ausgewählte
dimere Verbindungen wurden auf ihre Stabilität in PBS (pH = 7.4, 37 °C)
untersucht. Die genannten Verbindungen sind über den gesamten Zeitraum von 96
Stunden stabil und liegen im Zellmedium alle gelöst vor. Ihre
Sättigungslöslichkeiten liegen zwischen 190-670 µM, die pKs-Werte bei 9, so
dass sie zu 97.61 % protoniert im Zellmedium (pH = 7.4) vorliegen.
N-alkylierte Monomere zeigten in vorherigen Arbeiten gegenüber
unsubstituierten und C2-alkylierten 2-Imidazolinen eine Steigerung ihrer
agonistischen Wirkungen an ERalpha und beta. Untersuchungen ihrer Dimere an
U2OS-Zellen auf mögliche Luciferase-Expression, als auch Molecular Modeling
Studien zur Klärung der Interaktionen mit dem Estrogenrezeptor scheinen daher
interessant zu sein und können noch einen Ansatzpunkt für weitere Forschungen
sein.
de
dc.description.abstract
Bivalent meso-4,5-diaryl-2-imidazoline dihydrochlorides were synthesized among
others with 2-halo-4-hydroxy, 4-hydroxy and 4-fluorine substitution. Alkyl
spacers with a chain length of n = 4-10 have been attached. Through a modified
synthesis soon to be published by Vögtle and Goldschmitt
meso-1,2-diarylethylenediamines, which were substituted accordingly, were
obtained and converted with diiminodiethyl esters dihydrochlorides into
bivalent meso-4,5-diaryl-2-imidazoline dihydrochlorides with various chain
lengths (n = 4-10). Furthermore, the monomer
meso-4,5-bis(2,6-dichloro-4-hydroxyphenyl)-2-imidazoline hydrochloride has
been synthesized. 2-Halo-4-hydroxy substituted organic compounds have been
tested for affinity at ERalpha, beta and cytotoxicity. Compounds with
2-fluoro-4-hydroxy substitution showed neither cytotoxic nor
agonistic/antagonistic effects on the ER. All bivalent
2-chloro-4-hydroxy-2-imidazoline dihydrochloride caused no anti-proliferative
effect on hormone dependent MCF-7 mammary carcinoma cells. Using U2OS/alpha-
and U2OS/beta-cells the interactions of the dimers with the ERalpha, beta are
similar to their analogues monomers. Only the C4-analogue activated luciferase
expression. Anti-estrogenity had not been observed. Interestingly this
bivalent compounds influenced ERalpha-density in MCF-7 mammary carcinoma
cells. The C4-analogue stimulated the density. Other compounds reduced the
receptor density about 65 % at concentrations of 1 and 10 µM. None of the
tested compounds have a binding affinity to either one of the ER subtypes.
Only the 2,6-dichloro-4-hydroxy substituted monomer showed considerable effect
on U2OS cells. A luciferase expression of 50 % referred to the natural ligand
17beta-estradiol has been ascertained at the two subtypes at concentrations of
3.88•10-9 M as well as 4.7•10-10 M. This compound showed the strongest
agonistic effect in this work. 4-Hydroxy substituted compounds were inactive.
Antiproliferative effects on MCF-7 cells could not be observed even at
concentrations above 20 µM. The absence of a halogen substituent in the ortho
position causes them a loss of ERalpha, beta affinity. 4-Fluorine substituted
dimers were investigated for cytotoxicity and cell uptake at hormone dependent
MCF-7 mammary carcinoma cells. They showed strong cytotoxic effects. Their
IC50-values are in an upper nanomolar range [IC50: 60 (630 nM) > 61 (430 nM) >
62 (260 nM) > 63 (240 nM)]. With rising chain length this effect increased.
This correlates with a very strong cellular accumulation. The 2-imidazoline
monomer with fluorine substitution in para position however showed neither
cytotoxic effect nor a high cellular uptake. The cellular enrichment was
assessed with a new-developed method, the high resolution continuum source
atom absorption spectroscopy. An accumulation grade of 219 could be observed
with compound 61 after 60 minutes incubation of the cells with 2 µM. The
effect becomes more potent with rising chain length. After the same incubation
time for compound 62 cell admission increased an accumulation grade of 275.
Furthermore an accumulation grade of 412 has been observed for compound 63
after 40 minutes of incubation. Nevertheless, it has not become clear whether
the high degrees of enrichment are intracellular or whether they accumulate
only on the cell membrane. Because no pharmacological test system of the
membrane bounded GPR30 receptor exists, the participation in the cell
admission could not be proven so far. However, one possible evidence on
intracellular enrichment can be delivered through investigations with cellular
uptake inhibitors. In presence of methyl-beta-cyclodextrine (M-beta-CD) a
strong reduction of cell admission of the C10-compound could be observed. The
intracellular fluorine concentration has been reduced to 56 % which is almost
half of the control value. The influence of M-beta-CD might indicate a
caveolin-depended endocytosis of this substance. Some selected dimers were
tested for stability in PBS (pH = 7.4, 37 °C). They showed a good stability
over 96 hours and can be found soluted in the cell medium. Its saturation
solubility was between 190-670 µM. Their pKa values equal approximately 9, so
that they are protonated in thee cell medium to 97.61 % (pH = 7.4). Previous
works documented that monomers with N-alkylation compared to unsubstituted and
C2-alkylated 2-imidazolines increase their agonistic effects on ER subtypes.
Hence, investigations of their dimers at U2OS cells for possible luciferase
expression and molecular modeling studies for clarification interactions with
the estrogen receptor seem to be interesting for possible luciferase
expression.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
2-Imidazolin-Dimere
dc.subject
Luciferase-Assay
dc.subject
Zellaufnahme-Studien
dc.subject
meso-Bis(2,6-dichlor-4-hydroxyphenyl)-2-imidazolin
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie
dc.title
Synthese und Testung neuer Wirkstoffe mit höherer Affinität zum nukleären
Estrogenrezeptor und hoher Adsorptionsfähigkeit auf Oberflächen von
hormonabhängigen Tumorzellen
dc.contributor.contact
murat_ustunel@hotmail.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Ronald Gust
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Gerhard Wolber
dc.date.accepted
2015-02-25
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000098921-1
dc.title.translated
Synthesis and testing of new active compounds with higher affinity to the
nuclear estrogen receptor and high adsorption capacity on surfaces of hormone
dependent tumor cells
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000098921
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000016744
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open access