Investigating the role of Th17 cells in the initiation and chronification of autoimmune CNS demyelination

Abstract

T cells are critical for the pathogenesis of multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The invasion of encephalitogenic T cells through the blood-brain barrier (BBB) is considered as the initiatory event of the autoimmune pathology. However, antigen- specificity seems not to be essential for the transmigration step as non-CNS- specific T cells are also capable of entering the CNS without promoting any CNS pathology. It has recently been shown that Th17 cells are critically involved in the initiation of EAE. Their differentiation in vitro is dependent on the presence of the pro inflammatory cytokines IL-6 and IL-23 in the context of TGF-β. But there is a still a controversial debate around how far EAE and MS are rather Th1 or Th17 mediated diseases. In the first part of this thesis, the T cell differentiation requirements for a stable induction of EAE were investigated. The focus of experimental investigations was activation status, rounds of restimulation and differentiation (Th1 vs. Th17 cells). Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-specific T cells were completely primed in vitro to generate “pure” Th1 or Th17 cells arising from naïve T cells. Results show that the in vitro generated MOG specific Th17 cells are very capable of inducing EAE in wild type and lymphopenic recipients. Adoptive transfer of differentially stimulated IL-17 producing CD4+ T cells into C57BL/6 mice wild type recipients led to severe, non-remitting clinical EAE resulting in death in a small number of animals, whereas the lymphopenic Rag1-/- recipient mice presented with a fulminant and severely progressive EAE resulting in death in all animals transferred with the MOG-specific Th17 cells. High numbers of the MOG-specific Th17 cells were found in the CNS of the Rag1-/- and C57BL/6 mice. It was observed, that the lymphocytes re- isolated from the CNS of diseased animals showed a T cell lineage shift as they showed also increased IFN-γ production. Titration of MOG-specific Th17 cells showed that even low cell numbers could induce severe disease in the Rag1-/- recipient mice. Only repetitive in vitro stimulation ensured disease induction. Utilising magnet resonance imaging (MRI) blood-brain barrier (BBB) breakdown detected by contrast-agent (Gd-DTPA) enhancement was observed only in the Rag1-/- mice and was correlated to lymphocyte recruitment to the CNS using immunohistochemistry. Two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) visualised the potential of the MOG-specific CD4+ Th17 cells to promote neurodegeneration by directly contacting neurons. A comparison of the disease inducing potential of MOG-specific Th17 and Th1 in chronic neuroinflammation was made showing that also Th1 cells were able to induce EAE in Rag1-/- mice. The disease course was very mild when compared to adoptive transfer EAE induced with 2d2 Th17 cells. Additionally, alternative ways to induce adoptive transfer EAE were explored in the context of the investigation of the role of kinin receptor B1 (Bdkrb1). Here, encephalitogenic Bdkrb1 deficient and wild type T cells were transferred into Rag1-/- recipient mice. The transfer of these encephalitogenic T cells led to increased CD4+ T cell numbers in the CNS of mice transferred with encephalitogenic Bdkrb1-/- T cells. The proportion of CD4+ IL-17-secreting T cells was greater in the sick mice that received Bdkrb1-/- T cells, whereas the proportion of IFN-γ-producing T cells was comparable in mice that got Bdkrb1-/- T cells and wild type T cells, respectively. CD4+ Th17 cells treated with Bdkrb1 modulators or vehicle before allowing them to infiltrate into syngeneic hippocampal slice cultures showed a reduced infiltrative behaviour upon Bdkrb1 activation in TPLSM. In the second part, it was investigated if non-CNS-specific T cells that are able to enter the CNS may contribute to pathological processes such as induction of new clinical episodes in a bystander way. Background of this hypothesis is the epidemiological evidence that MS patients which suffer from trivial systemic infection, e.g. of the upper respiratory tracts, are highly prone to consecutively develop a relapse of the CNS disease. It could be demonstrated that OVA-specific Th17 cells are able to induce relapses in chronically sick mice when compared to vehicle control. They are not able to do so in healthy wild type and lymphopenic mice. The OVA-specific Th17 cells show no cross- reactivity with myelin-antigens and therefore seem to contribute to neuropathological processes in the bystander way. OVA specific Th17 cells have also been shown to directly contact neurons and induce damage much similar to MOG-specific Th17 cells. Taken together, these results indicate that repetitive restimulation of MOG-specific Th17 cells is necessary to yield a highly encephalitogenic Th17 subset, which is a potent inducer of EAE in an adoptive transfer model and that also non-CNS-specific Th17 cells can induce relapses in animals with pre-existing CNS pathology and that the kallikrein- kinin system is involved in the regulation of CNS inflammation, limiting encephalitogenic T lymphocyte infiltration into the CNS.

T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Multiplen Sklerose (MS) und ihres Tiermodells, der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE). Die Invasion von enzephalitogenen T-Zellen über die Blut-Hirn-Schranke wird als Anfangspunkt für die autoimmune Pathologie betrachtet. Antigenspezifität scheint für diesen Prozess keine Rolle zu spielen, da sowohl Zellen die spezifisch wie auch unspezifisch für Antigene im Zentralen Nervensystem (ZNS) sind, die Blut-Hirn-Schranke passieren können. Kürzlich, konnte gezeigt werden, dass Th17-Zellen an der Initiierung von EAE beteiligt sind. Ihre Differenzierung in vitro ist abhängig von den proinflammatorischen Zytokinen IL-6 und IL 23 im Zusammenhang mit TGF-β. Im Moment gibt es eine kontroverse Debatte darüber, ob MS und EAE Th1- oder Th17-Zellvermittelte Krankheiten sind. Im ersten Teil der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, welche Voraussetzungen in der Differenzierung von T-Zellen für die Induktion von EAE nötig sind. Dabei wurde ein Schwerpunkt auf den Aktivierungsstatus der Zellen, die Anzahl der Restimulationen und den Differenzierungsstatus (Th1- vs. Th17-Zellen) gelegt. Aus naiven Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG)-spezifischen T-Zellen wurden in vitro “reine” Th1- oder Th17- Zellen generiert. Die Ergebnisse zeigen, dass adoptiver Transfer von unterschiedlich oft stimulierten IL 17 produzierenden CD4+ T-Zellen zu einem schweren Krankheitsverlauf sowohl in C57BL/6 Wildtyp Mäusen, als auch in Rag1-/- Mäusen führten. MOG-spezifische Th17-Zellen wurden im ZNS der Rag1-/- und C57BL/6 Mäuse wiedergefunden und zeichneten sich hier durch einen Phänotypwechsel aus, da sie eine erhöhte Produktion von IFN-γ aufzeigten. Eine Titration der Zellen zeigte, dass bereits geringe Zellzahlen in der Lage sind EAE in Rag1-/-Mäusen auszulösen. Mithilfe von Magnetresonanztomographie konnte die zellverursachte Zerstörung der Blut-Hirn- Schranke in Rag1-/- Mäusen beobachtet werden und mit der Rekrutierung von Lymphozyten immunohistologisch korreliert werden. Zwei-Photonen Mikroskopie wurde verwendet um das Potential der MOG-spezifischen CD4+ Th17-Zellen zur Neurodegeneration durch direkten Kontakt mit Neuronen zu visualisieren. Ein Vergleich MOG-spezifischer Th1- und Th17-Zellen in chronischer Neuroinflammation veranschaulichte, dass Th1-Zellen zwar fähig sind EAE in Rag1-/- Mäusen zu induzieren, dass aber in sehr viel abgeschwächterer Form als Th17-Zellen. Zusätzlich wurde die Rolle des Kininrezeptor B1 (Bdkrb1) untersucht. Hierfür wurde eine klassische passive EAE induziert. Bdkrb1-defiziente T-Zellen wurden in Rag1-/- Mäuse transferiert und mit Wildtyp T-Zellen verglichen. Es konnte eine erhöhte Anzahl CD4+ T-Zellen im ZNS der Tiere, die die Bdkrb1-defizienten T-Zellen erhalten haben, nachgewiesen werden. Der Anteil IL 17 produzierender Zellen in dieser CD4+ Fraktion war ebenfalls erhöht. CD4+ T-Zellen, die mit Modulatoren für Bdkrb1 behandelt wurden, zeigten ein weniger invasives Verhalten in hippocampalen Gehirnschnitten im Zwei-Photonen Mikroskop. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Verhalten ZNS-unspezifischer T-Zellen untersucht. Dabei sollte gezeigt werden, ob diese ZNS-unspezifischen T-Zellen in der Lage sind ins ZNS zu gelangen und dort zerstörerische Prozesse anzuregen. Basierend auf dem Hintergrund, dass in MS Patienten, die an einer gewöhnlichen Infektion leiden, Schübe beobachtet werden können, sollte das Verhalten der ZNS-unspezifischen T-Zellen untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass ZNS-unspezifische T-Zellen in der Lage sind Schübe in chronisch kranken Mäusen zu induzieren. Die T-Zellen waren nicht in der Lage EAE in gesunden Tieren auszulösen und zeigten keine Kreuzreaktivität zu ZNS Antigenen auf, was darauf hinweist, dass sie eine sekundäre Rolle in der Zerstörungskaskade der EAE haben, obwohl aufgezeigt werden konnte, dass sie durchaus direkt auch Neuronen angreifen können. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse auf, dass wiederholte Stimulation MOG spezifischer Th17-Zellen essentiell ist um eine hochenzephalitogene Zellpopulation zu schaffen, die EAE sehr effizient induzieren kann. ZNS-unspezifische T-Zellen sind in der Lage Schübe in chronisch kranken Tieren zu induzieren und der Kininrezeptor B1 scheint eine Rolle in der Regulation von entzündlichen Prozessen im ZNS zu spielen, indem er die Transmigration von T-Zellen ins ZNS verhindert.