Langzeitanalyse der neurovaskulären Einheit nach ischämischem Schlaganfall mittels Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie

Abstract

Ein ischämischer Schlaganfall wird durch den akuten Verschluss eines relevanten Hirngefäßes verursacht und bewirkt eine Sauerstoff- und Nährstoffunterversorgung in dem betroffenen Hirnareal. Folglich beginnt eine Kaskade von pathologischen Prozessen, die das Absterben von Zellen und damit den Funktionsverlust dieser Hirnregion zur Folge haben kann. Bei der Patientin oder dem Patienten kann dies irreversible körperliche oder geistige Behinderungen und sogar den Tod verursachen. Das Ziel aktueller Forschung ist es, die pathophysiologischen Prozesse nach ischämischem Schlaganfall detaillierter zu verstehen und mögliche Therapien zu entwickeln. Der Fokus der vorliegenden Arbeit liegt auf der Detektion und Analyse der Veränderungen der neurovaskulären Einheit nach ischämischem Schlaganfall. Der Begriff neurovaskuläre Einheit beschreibt die komplexe Interaktion aus Endothelzellen, Neurone, Astrozyten, Myozyten, Perizyten und Komponenten der extrazellulären Matrix, die den Austausch von Substanzen zwischen Blutgefäßsystem und Hirnparenchym reguliert. Zur Untersuchung der Folgen des ischämischen Schlaganfalls in Bezug auf die neurovaskuläre Einheit stellte die Untersuchung mittels konfokaler Laserscanmikroskopie von post mortem immunhistochemisch fluoreszenzmarkierten Hirnschnitten den bisherigen Goldstandard dar. Die in vivo Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine multidimensionale, longitudinale Analyse der neurovaskulären Einheit und stellt u.a. aufgrund der höheren Eindringtiefe einen erheblichen methodischen Fortschritt dar. Für die Induktion des ischämischen Schlaganfalls verwendeten wir das Mausmodell der distalen Okklusion der Arteria cerebri media mittels Elektrokoagulation. Weiterhin wurde ein chronisch kraniales Fenster implantiert, welches die in vivo Untersuchungen an Tag 3, 7 und 28 nach distaler Okklusion der Arteria cerebri media ermöglichte. Mittels statistischer Analyse wurden die Parameter Gefäßdurchmesser und Gefäßdichte nach distaler Okklusion der Arteria cerebri media mit einer Kontrollgruppe verglichen. Es zeigte sich eine signifikante Erhöhung des Gefäßdurchmessers an Tag 3 nach der Intervention im Vergleich zur Kontrollgruppe. Zudem deutete sich eine erhöhte Neubildung von Blutgefäßen an Tag 7 nach distaler Okklusion der Arteria cerebri media aufgrund der im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhten Gefäßdichte an. An Tag 28 nach der Intervention wurde ein weitgehend rehabilitiertes Gefäßsystem beobachtet. Kein signifikanter Unterschied konnte hinsichtlich der genannten Parameter zwischen Infarktkern und Peri-Infarktzone detektiert werden. Die in vivo Untersuchung mittels Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie stellt eine hervorragende Möglichkeit dar, die neurovaskuläre Einheit nach ischämischem Schlaganfall am Mausmodell zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit stellt die Methodik und die Ergebnisse dieser Untersuchungen vor und diskutiert Grenzen und Verbesserungsmöglichkeiten.

An ischemic stroke is caused by the acute occlusion of a relevant, brain-supplying vessel and causes an oxygen and nutrient shortage in the affected brain area. As a result, a cascade of pathological processes is initiated, which leads to cell death and loss of function in the affected area of the brain. This can cause irreversible physical or mental disabilities and even the patient’s death. The aim of today’s research is to understand the pathophysiological processes after ischemic stroke in more detail and, if possible, to intervene medically in order to improve the patient's treatment outcome. Current studies focus on the characterization and the analysis of the damage inflicted on the neurovascular unit after ischemic stroke. The term neurovascular unit describes the complex interaction of endothelial cells, neurons, astrocytes, myocytes, pericytes and components of the extracellular matrix that regulate the exchange of substances between the blood vessel system and the brain parenchyma. Examination by means of confocal laser scanning microscopy of post mortem immunohistochemically fluorescence-labeled brain slices has been the gold standard to investigate the consequences of ischemic stroke inflicted on the neurovascular unit. In vivo two-photon laser scanning fluorescence microscopy enables a multidimensional, longitudinal analysis of the neurovascular unit and represents a significant methodological progress due to the greater penetration depth, amongst other things. To induce the ischemic stroke, we used the mouse model of the distal middle cerebral artery occlusion using electrocoagulation. Furthermore, a chronic cranial window was implanted, which enabled in vivo investigations on days 3, 7 and 28 after distal middle cerebral artery occlusion. Using statistical analysis, the parameters vessel diameter and vessel density after distal middle cerebral artery occlusion were compared with a control group. There was a significant increase in the vessel diameter on day 3 after the intervention compared to the control group. In addition, there was an increased formation of new blood vessels on day 7 after distal middle cerebral artery occlusion due to the trend towards increased vessel density. A largely rehabilitated vascular system could be observed on day 28 after the intervention. No significant difference could be detected between the ischemic core and the peri-infarct zone with regard to the parameters mentioned. The in vivo investigation using two-photon laser scanning fluorescence microscopy is an excellent method to study the neurovascular unit after ischemic stroke in a mouse model in vivo. This thesis presents the methodology and the results of these investigations and also discusses limitations and possibilities for improvement.