Isoformspezifische Regulation der Säuger-Adenylylcyclasen ACI und ACII durch Calcium/Calmodulin und Gβγ

Abstract

Der universelle second messenger cAMP spielt in der komplexen Signaltransduktion des Säugerorganismus eine zentrale Rolle. Er steuert lebenswichtige Prozesse wie Zellwachstum, Differentiation bis hin zur Transkriptionskontrolle und Apoptose. Voraussetzung für eine zell- und gewebs- spezifische Abstimmung der cAMP-vermittelten Vorgänge ist die präzise Regulation der für die cAMP-Synthese verantwortlichen Enzyme, der Adenylylcyclasen (AC). Es sind heute neun membranständige Säuger-ACs (ACI- ACIX) bekannt. Neben der allen gemeinsamen Stimulierbarkeit durch G£s weisen die neun Isoformen individuelle Regulationsmuster gegenüber G-Proteinen, Calcium und Kinasen auf. Mit ihrer Fähigkeit, als Coinzidenzdetektoren mehrere regulatorische Signale zu integrieren, ermöglichen die ACs den cross-talk verschiedener Signalwege. Die genaue Kenntnis der hot spots, über die eine Umsetzung der regulatorischen Signale auf den ACs erfolgt, würde es ermöglichen, bestimmte Signalkaskaden gezielt zu modulieren, ohne das gesamte Rezeptor-getriggerte Signalnetzwerk zu beeinflussen. Auf molekularer Ebene ist bislang jedoch wenig bezüglich der isoform-spezifischen AC-Regulationen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden Regulationsmotive der Isoformen ACI und ACII im Hinblick auf ihren spezifischen Aktivator Calcium/Calmodulin (Ca/CaM) und Gβγ untersucht. Es ist gelungen, die ersten Motive auf einer AC zu identifizieren, die nachweislich für die Vermittlung des Gβγ-Signals notwendig sind: das PFAHL-Motiv auf der variablen C1b-Dom.ne der ACII, die KF- Schleife auf der katalytischen C2a-Domäne der ACII. Im Rahmen der Gβγ-Studie wurde neben den die Isoform ACII betreffenden Daten eine bislang unbekannte Regulation einer anderen AC-Isoform aufgedeckt: Die Isoform ACIII wird in vitro direkt durch Gβγ inhibiert. Bezüglich der ACI-Stimulation durch Ca/CaM war bereits ein Regulationsmotiv, die AC28-Region, bekannt. Es ist in der variablen C1b-Domäne lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass: die C1b-Dom.ne der ACI mit dem AC28-Motiv nicht hinreichend für die ACI- Stimulation durch Ca/CaM ist, die katalytische C2a-Domäne der ACI ebenfalls essentiell für die ACI-Stimulation durch Ca/CaM ist. Sie besitzt das VLG- Motiv, von dem eine direkte Interaktion mit Ca/CaM nachgewiesen werden konnte. Die vorgestellten Daten machen deutlich, dass in beiden Fällen nicht nur eine einzige Schnittstelle zwischen Regulator und AC existiert, sondern dass mehrere strukturell getrennte AC-Regionen für die Umsetzung des regulatorischen Signals von elementarer Bedeutung sind. Eine Funktionsaufteilung der verschiedenen Regulationsmotive in reine Bindungs- und in Signaltransfer-Regionen wird diskutiert.

The universal second messenger cAMP plays a key role in the mammalian intracellular signal transduction. It controls a variety of pivotal cell functions ranging from cell growth and differentiation to transcriptional regulation and apoptosis. The key step in the regulation of cAMP is the exact cell/tissue-specific modulation of those enzymes that synthesize cAMP: the adenylyl cyclases (ACs). Particular mammalian ACs are represented by at least nine different isoforms (ACI-ACIX). All isoforms are susceptible to the stimulatory α-subunit of heterotrimeric G proteins (Gαs), besides that each AC is uniquely regulated by multiple signals from G proteins, calcium and kinases. Due to their competency as detectors and integrators of coincident regulatory signals they form intersection points for the cross-talk of different signaling pathways. Thereby, the regulatory hot spots on the AC molecules represent ideal targets to selectively modulate branches of bifurcated cascades without affecting the complete receptor-triggered signaling network. Up to now little is known about the detailed mechanisms underlying the isoform-specific regulation of ACs. In the present study molecular insights in the isoform-specific stimulation of ACII by Gβγ and ACI by calcium/calmodulin (Ca/CaM) were yielded. For the first time we have identified motifs on an AC enzyme that could be proven to be necessary for the Gβγ-regulatory effect: the PFAHL-motif localized on the variable C1b-domain of ACII, the KF-loop localized on the catalytic C2a-domain of ACII. Apart from the data regarding isoform ACII, a new Gβγ-regulatory pathway was discovered for isoform ACIII: The ACIII is directly inhibited by Gβγ in vitro. In terms of the stimulation of isoform ACI by Ca/CaM there was already one regulatory motif known: the AC28-region localized on the variable C1b-domain of ACI. In the present work we have figured out that: the C1b-domain is not sufficient for the ACI-stimulation by Ca/CaM, the catalytic C2a-domain of ACI is also crucial for the ACI-stimulation by Ca/CaM. We have identified the VLG-motif on this domain and provided evidence for a direct interaction between Ca/CaM and this sequence. The data presented here reveal that the regulatory signal transfer is based on more than one molecular interface between regulator and effector. Different roles of the regulatory motifs as signal transfer regions or general binding domains are discussed.