Der Einfluss des Ubiquitin-Proteasom-Systems auf das Adaptationsverhalten neonataler Rattenkardiomyozyten

Abstract

Den hier durchgeführten Versuchen lag die Beobachtung zugrunde, dass sich in unserem Labor in Vorversuchen mit NRCs durch eine Inhibition des Ubiquitin- Proteasom-Systems die Entwicklung einer serum-induzierten Zunahme der Zellgröße, zunächst rein morphologisch, verhindern ließ. Basierend auf dieser Beobachtung sollte untersucht werden, inwiefern es sich bei dieser Suppression der Hypertrophie um einen generellen Einfluss von Proteasominhibitoren auf das Adaptationsverhalten von NRCs handelt. Als in vitro-Modell diente die in unserem Labor etablierte Kultur neonataler Rattenkardiomyozyten. Zunächst wurden die Zellen auf rein morphologischer Ebene betrachtet. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die Ausbildung des durch die Stimulation mit Serum induzierten morphologischen Phänotyps (gekennzeichnet durch größere Myozyten mit abgeflachten Zellkörpern und kurzen, kräftigen Ausläufern) durch gleichzeitige Inkubation mit dem Proteasominhibitor MG132 verhindern ließ. Des Weiteren konnte auch in serumfrei kultivierten Zellen demonstriert werden, dass NRCs bei Behandlung mit dem Proteasominhibitor eine offenbar proteasomspezifische Morphologie entwickeln, die durch eher längliche Zellkörper mit schlanken Zellfortsätzen charakterisiert war, insgesamt erschienen diese Zellen vitaler und kräftiger als die in Abwesenheit von Serum kultivierten NRCs. Der Einfluss einer Proteasominhibition auf RNA-Ebene wurde mit Hilfe der Realtime-PCR untersucht. Die Zellen wurden sowohl in An- und Abwesenheit von Serum, als auch in Anwesenheit ausgewählter Wachstumsfaktoren kultiviert. Als Vertreter der verschiedenen Substanzklassen wurden Endothelin-1, Insulin-like growth factor (IGF), Isoproterenol als α-adrenerger Agonist und Triiodthyronin (T3) betrachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibition des Proteasoms sich auch auf die Genexpression der Zellen auswirkte. Es wurden alpha-myosin-heavy-chain, beta-myosin-heavy-chain, alpha- smooth-muscle-actin, cardiac-alpha-actin und myosin-light-chain-2 als exemplarische Hypertrophiemarkergene ausgewählt. Anhand der Realtime-PCR wurde die Expression dieser Gene unter den jeweiligen Kulturbedingungen relativ quantifiziert. Für die oben genannten Stimuli war unter Proteasominhibition einheitlich eine verminderte Expression der Hypertrophiemarkergene zu beobachten. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die durch Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems verursachte Suppression der Hypertrophie unabhängig vom jeweiligen Agonisten ist. Auch auf Proteinebene konnte am Beispiel von alpha-smooth-muscle-actin die Beeinflussung des Gehalts an Markerproteinen durch Inhibition des Proteasoms gezeigt werden, in Abhängigkeit von der Konzentration des Proteasominhibitors konnte eine Abnahme der Proteinmenge beobachtet werden. In der Immunfluoreszenzfärbung wurde, wiederum am Beispiel von alpha-smooth-muscle-actin, demonstriert, dass die Inhibition des Proteasoms die Organisation des kontraktilen Apparates beeinflusste und sich auf den zellulären Einbau von strukturellen Proteinen auswirkte. Die effiziente Inhibition des Proteasoms in Abhängigkeit von der verwendeten Dosis MG132 wurde im Western Blot durch die Akkumulation polyubiquitinierter Proteine nachgewiesen. Ausgehend von der Beobachtung, dass die Proteasominhibition sowohl in serumfrei als auch in in Anwesenheit von Serum kultivierten NRCs die Ausbildung einer Skelettmuskelzellen ähnelnden Morphologie bewirkte, wurde die Expression von MyoD und Myogenin, zweier Schlüsselgene der myogenen Differenzierung, untersucht. Dabei zeigte sich, dass in allen betrachteten Zellen durch MG132 die Expression dieser Gene beeinflusst wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die Hypothese bestätigt werden, dass das Ubiquitin-Proteasom-System am Adaptationsprozess neonataler Rattenkardiomyozyten, wie etwa im Rahmen einer kardialen Hypertrophie, beteiligt ist, und dass eine Proteasominhibition eine Suppression der Kardiomyozytenhypertrophie unabhängig vom verwendeten Agonisten induziert.

The experiments in this dissertation were based on the observation made in our laboratory that in neonatal rat cardiomyocytes (NRCs), the development of a serum-induced hypertrophic reaction (i.e. increase in cell size) could be prevented by the inhibition of the Ubiquitin Proteasome System. Based on this observation it was intended to investigate whether this suppression of hypertrophy depicted a general influence of proteasome inhibitors on the adaptation process of NRCs. As in-vitro model neonatal rat cardiomyocytes in cell culture were used, a model well- established in our laboratory. At first the cells were examined on the morphological level. On this level it could be demonstrated, that the development of the serum-induced morphological phenotype (characterized by larger myocytes with flattened cell bodies and short, well-developed extensions) was prevented by co-incubation with the proteasome inhibitor MG132. It also could be shown in cells cultured in the absence of serum, that in the presence of MG132 these NRCs developed a specific morphology, characterised by longish cell bodies with slim extensions. All in all these cells appeared to be more vital and stronger than the cells cultivated in the absence of serum but without MG132. On the level of RNA-Expression the influence of inhibition of the proteasome was examined by means of the Realtime-PCR. Cells were cultivated in presence and absence of fetal calf serum, as well as in presence of various different growth factors. As representatives of the different substance classes of growth stimuli the effects of Endothelin-1, Insulin-like growth factor (IGF), Isoproterenol as α-adrenergic agonist and Triiodthyronine (T3) were observed. It could be demonstrated that inhibition of the proteasome also affected the gene expression of the cells. alpha-myosin-heavy-chain, beta-myosin-heavy-chain, alpha-smooth-muscle-actin, cardiac-alpha-actin and myosin-light-chain-2 were chosen as exemplarily hypertrophic markergenes. Using the Realtime-PCR, the expression of these genes depending on the conditions of cell culture was relatively quantified For the stimuli mentioned above, inhibition of the proteasome caused a consistent reduction of the expression of the examined marker genes. This might indicate the fact, that the suppression of any hypertrophic reaction by inhibition of the proteasome is independent of the hypertrophy-inducing agonist. Using the example of alpha-smooth-muscle-actin it could be shown also on protein level that inhibition of the proteasome as well had influence on the amount of marker proteins. Subject to the concentration of the proteasome inhibitor a reduction of protein content could be demonstrated. Again using the example of alpha-smooth-muscle-actin, it could be illustrated that inhibition of the proteasome had an effect on the organisation of the contractile apparatus and affected the assembly of structural proteins. This could be shown by immunofluorescent staining of the before-mentioned protein. Efficient inhibition of the proteasome in a dose- dependent manner could be proved by the accumulation of polyubiquitinated proteins using western blot analysis. Based on the observation that inhibition of the proteasome led to the development of a morphology resembling skeletal muscle cells in cells cultivated in the presence as well as in the absence of fetal calf serum, the expression of MyoD and Myogenin, being two key regulator genes of myogenic differentiation, was examined. It could be demonstrated that in all examined cells the expression of these genes was affected by the presence of MG 132. In this dissertation the hypothesis that the Ubiquitin Proteasome System is involved in the adaptation process of neonatal rat cardiomyocytes (as for example in the context of cardiac hypertrophy) could be confirmed for the first time. Also it could be proven that inhibition of the proteasome induces a suppression of cardiomyocyte hypertrophy independent of the growth stimulus which is used to induce hypertrophy