dc.contributor.author
Leykam, Pia
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:52:59Z
dc.date.available
2008-01-08T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4386
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8586
dc.description
Gesamtdissertation
dc.description.abstract
Den hier durchgeführten Versuchen lag die Beobachtung zugrunde, dass sich in
unserem Labor in Vorversuchen mit NRCs durch eine Inhibition des Ubiquitin-
Proteasom-Systems die Entwicklung einer serum-induzierten Zunahme der
Zellgröße, zunächst rein morphologisch, verhindern ließ. Basierend auf dieser
Beobachtung sollte untersucht werden, inwiefern es sich bei dieser Suppression
der Hypertrophie um einen generellen Einfluss von Proteasominhibitoren auf das
Adaptationsverhalten von NRCs handelt. Als in vitro-Modell diente die in
unserem Labor etablierte Kultur neonataler Rattenkardiomyozyten. Zunächst
wurden die Zellen auf rein morphologischer Ebene betrachtet. Dabei konnte
gezeigt werden, dass sich die Ausbildung des durch die Stimulation mit Serum
induzierten morphologischen Phänotyps (gekennzeichnet durch größere Myozyten
mit abgeflachten Zellkörpern und kurzen, kräftigen Ausläufern) durch
gleichzeitige Inkubation mit dem Proteasominhibitor MG132 verhindern ließ. Des
Weiteren konnte auch in serumfrei kultivierten Zellen demonstriert werden,
dass NRCs bei Behandlung mit dem Proteasominhibitor eine offenbar
proteasomspezifische Morphologie entwickeln, die durch eher längliche
Zellkörper mit schlanken Zellfortsätzen charakterisiert war, insgesamt
erschienen diese Zellen vitaler und kräftiger als die in Abwesenheit von Serum
kultivierten NRCs. Der Einfluss einer Proteasominhibition auf RNA-Ebene wurde
mit Hilfe der Realtime-PCR untersucht. Die Zellen wurden sowohl in An- und
Abwesenheit von Serum, als auch in Anwesenheit ausgewählter Wachstumsfaktoren
kultiviert. Als Vertreter der verschiedenen Substanzklassen wurden
Endothelin-1, Insulin-like growth factor (IGF), Isoproterenol als α-adrenerger
Agonist und Triiodthyronin (T3) betrachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die
Inhibition des Proteasoms sich auch auf die Genexpression der Zellen
auswirkte. Es wurden alpha-myosin-heavy-chain, beta-myosin-heavy-chain, alpha-
smooth-muscle-actin, cardiac-alpha-actin und myosin-light-chain-2 als
exemplarische Hypertrophiemarkergene ausgewählt. Anhand der Realtime-PCR wurde
die Expression dieser Gene unter den jeweiligen Kulturbedingungen relativ
quantifiziert. Für die oben genannten Stimuli war unter Proteasominhibition
einheitlich eine verminderte Expression der Hypertrophiemarkergene zu
beobachten. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die durch Inhibition des
Ubiquitin-Proteasom-Systems verursachte Suppression der Hypertrophie
unabhängig vom jeweiligen Agonisten ist. Auch auf Proteinebene konnte am
Beispiel von alpha-smooth-muscle-actin die Beeinflussung des Gehalts an
Markerproteinen durch Inhibition des Proteasoms gezeigt werden, in
Abhängigkeit von der Konzentration des Proteasominhibitors konnte eine Abnahme
der Proteinmenge beobachtet werden. In der Immunfluoreszenzfärbung wurde,
wiederum am Beispiel von alpha-smooth-muscle-actin, demonstriert, dass die
Inhibition des Proteasoms die Organisation des kontraktilen Apparates
beeinflusste und sich auf den zellulären Einbau von strukturellen Proteinen
auswirkte. Die effiziente Inhibition des Proteasoms in Abhängigkeit von der
verwendeten Dosis MG132 wurde im Western Blot durch die Akkumulation
polyubiquitinierter Proteine nachgewiesen. Ausgehend von der Beobachtung, dass
die Proteasominhibition sowohl in serumfrei als auch in in Anwesenheit von
Serum kultivierten NRCs die Ausbildung einer Skelettmuskelzellen ähnelnden
Morphologie bewirkte, wurde die Expression von MyoD und Myogenin, zweier
Schlüsselgene der myogenen Differenzierung, untersucht. Dabei zeigte sich,
dass in allen betrachteten Zellen durch MG132 die Expression dieser Gene
beeinflusst wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die Hypothese
bestätigt werden, dass das Ubiquitin-Proteasom-System am Adaptationsprozess
neonataler Rattenkardiomyozyten, wie etwa im Rahmen einer kardialen
Hypertrophie, beteiligt ist, und dass eine Proteasominhibition eine
Suppression der Kardiomyozytenhypertrophie unabhängig vom verwendeten
Agonisten induziert.
de
dc.description.abstract
The experiments in this dissertation were based on the observation made in our
laboratory that in neonatal rat cardiomyocytes (NRCs), the development of a
serum-induced hypertrophic reaction (i.e. increase in cell size) could be
prevented by the inhibition of the Ubiquitin Proteasome System. Based on this
observation it was intended to investigate whether this suppression of
hypertrophy depicted a general influence of proteasome inhibitors on the
adaptation process of NRCs. As in-vitro model neonatal rat cardiomyocytes in
cell culture were used, a model well- established in our laboratory. At first
the cells were examined on the morphological level. On this level it could be
demonstrated, that the development of the serum-induced morphological
phenotype (characterized by larger myocytes with flattened cell bodies and
short, well-developed extensions) was prevented by co-incubation with the
proteasome inhibitor MG132. It also could be shown in cells cultured in the
absence of serum, that in the presence of MG132 these NRCs developed a
specific morphology, characterised by longish cell bodies with slim
extensions. All in all these cells appeared to be more vital and stronger than
the cells cultivated in the absence of serum but without MG132. On the level
of RNA-Expression the influence of inhibition of the proteasome was examined
by means of the Realtime-PCR. Cells were cultivated in presence and absence of
fetal calf serum, as well as in presence of various different growth factors.
As representatives of the different substance classes of growth stimuli the
effects of Endothelin-1, Insulin-like growth factor (IGF), Isoproterenol as
α-adrenergic agonist and Triiodthyronine (T3) were observed. It could be
demonstrated that inhibition of the proteasome also affected the gene
expression of the cells. alpha-myosin-heavy-chain, beta-myosin-heavy-chain,
alpha-smooth-muscle-actin, cardiac-alpha-actin and myosin-light-chain-2 were
chosen as exemplarily hypertrophic markergenes. Using the Realtime-PCR, the
expression of these genes depending on the conditions of cell culture was
relatively quantified For the stimuli mentioned above, inhibition of the
proteasome caused a consistent reduction of the expression of the examined
marker genes. This might indicate the fact, that the suppression of any
hypertrophic reaction by inhibition of the proteasome is independent of the
hypertrophy-inducing agonist. Using the example of alpha-smooth-muscle-actin
it could be shown also on protein level that inhibition of the proteasome as
well had influence on the amount of marker proteins. Subject to the
concentration of the proteasome inhibitor a reduction of protein content could
be demonstrated. Again using the example of alpha-smooth-muscle-actin, it
could be illustrated that inhibition of the proteasome had an effect on the
organisation of the contractile apparatus and affected the assembly of
structural proteins. This could be shown by immunofluorescent staining of the
before-mentioned protein. Efficient inhibition of the proteasome in a dose-
dependent manner could be proved by the accumulation of polyubiquitinated
proteins using western blot analysis. Based on the observation that inhibition
of the proteasome led to the development of a morphology resembling skeletal
muscle cells in cells cultivated in the presence as well as in the absence of
fetal calf serum, the expression of MyoD and Myogenin, being two key regulator
genes of myogenic differentiation, was examined. It could be demonstrated that
in all examined cells the expression of these genes was affected by the
presence of MG 132. In this dissertation the hypothesis that the Ubiquitin
Proteasome System is involved in the adaptation process of neonatal rat
cardiomyocytes (as for example in the context of cardiac hypertrophy) could be
confirmed for the first time. Also it could be proven that inhibition of the
proteasome induces a suppression of cardiomyocyte hypertrophy independent of
the growth stimulus which is used to induce hypertrophy
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
neonatal rat cardiomyocytes
dc.subject
gene expression
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Der Einfluss des Ubiquitin-Proteasom-Systems auf das Adaptationsverhalten
neonataler Rattenkardiomyozyten
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. med. K. Stangl
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. med. T. Eschenhagen
dc.contributor.furtherReferee
Priv.-Doz. Dr. med. A. Staudt
dc.date.accepted
2008-02-22
dc.date.embargoEnd
2007-01-12
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000003599-8
dc.title.translated
The Influence Of The Ubiquitin Proteasome System On The Adaptation Behaviour
Of Neonatal Rat Cardiomyocytes
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000003599
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2008/27/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000003599
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access