Kryo-Elektronenmikroskopie makromolekularer Maschinen: Strukturaufklärung der Hepatitis C Virus "internal ribosomal entry site" und ihre Wechselwirkung mit dem Translationsapparat

Abstract

Die Proteinbiosynthese (Translation) ist ein komplexer Prozess, der in allen lebenden Zellen für die Genexpression notwendig ist. Ihr Hauptakteur ist das Ribosom, ein hochflexibler makromolekularer Ribonukleoproteinkomplex. Die Translation umfasst vier sequentielle Phasen, bezeichnet als Initiation, Elongation, Termination und Ribosomen Recycling. Als erster Schritt der Translation ist die Initiation die Phase, welche am häufigsten spezifischen Regulationsmechanismen unterworfen ist. Der Standardmechanismus in Eukaryoten, die kanonische Initiation, ist ein sehr komplexer Vorgang und beinhaltet eine Vielzahl von regulatorischen Faktoren (Initiationsfaktoren, eIFs). Rekrutierung, Positionierung und Aktivierung der Translationsmaschinerie die 5´-terminale „Cap“-Strukutur der mRNA und einen ATP-abhängigen „Scanning“-Mechanismus. Daneben existiert jedoch auch ein alternativer Weg der Translationsinitiation: die interne Initiation. Einige mRNAs können „Cap“-Bindung, „Scanning“ und die Notwendigkeit einiger oder sogar aller eIFs durch spezielle strukturierte Sequenzen in ihrer 5’-UTR, interne Ribosomen Eintrittsstellen (IRESs), umgehen. Während zelluläre IRES-enthaltende mRNAs oft für wichtige regulatorische Proteine kodieren, stellen IRES-Elemente für Viren effiziente Werkzeuge zur Übernahme des Translationsapparates ihrer Wirtszellen dar. Sie funktionieren selbst dann noch, wenn die kanonische Translationsinitiation beeinträchtigt ist. Das IRES-Elemente des Hepatitis C Virus (HCV) und verwandter Viren der Flaviviridae Familie, wie dem Virus der klassischen Schweinepest (CSFV), bilden eine funktionell wichtige Tertiärstruktur aus, die das eukaryotische Ribosom aktiv beeinflussen kann. Die HCV IRES erlaubt in Gegenwart von erhöhten Mg2+ und Ca2+ Konzentrationen eine vollständig Initiationsfaktor-unabhängige Translation. Dieser Umstand wird in der hier vorliegenden Promotionsarbeit genutzt, um für die Kryo-EM ausreichend stabile 80S • IRES Komplexe in vitro zu rekonstituieren und zu isolieren. Es wird eine Kryo-EM Dichtekarte des Säugetier 80S Ribosoms im Komplex mit der HCV IRES bei einer deutlich verbesserten Auflösung von 7,8 Å präsentiert, die erstmalig die Erstellung eines vollständigen molekularen Tertiärstrukturmodells der HCV IRES in der ribosomengebundenen Form ermöglicht. Dieses Modell offenbart eine komplexe dreidimensionale Faltung der IRES RNA und molekulare Details ihrer Wechselwirkungen mit dem Ribosom. Die Proteine rpS1e, rpS5e, rpS14e, rpS25, rpS26e, rpS27, rpS28e sowie die Helices h23 und h26 der 18S rRNA können als Interaktionspartner in Kopf- und Plattform-Domäne der ribosomalen 40S Untereinheit klar identifiziert werden. Ein strukturelles Shine Dalgarno - anti Shine Dalgarno Mimicry durch die IRES wird vorgeschlagen. Zusätzlich konnte in dieser Studie zum ersten Mal eine Kryo-EM Dichtekarte des Säugetier 80S Ribosoms im Komplex mit der verwandten CSFV IRES bei einer Auflösung von 10 Å präsentiert werden. Der Vergleich mit den HCV IRES-Komplexen unterstreicht die hohe strukturelle Konservierung dieser mRNA Signalstrukturen.

Proteinbiosynthesis (translation) is a complex process, necessary for gene expression in all living cells. Translation involves four sequential phases, namely initiation, elongation, termination and ribosome recycling. As the first step of translation initiation is the phase which is most frequently subjected to specific regulation mechanisms. The standard mechanism in eucaryotes, canonical initiation, is a very complex pathway including a plethora of regulatory factors (initiation factors, eIFs). In addition recruitment, positioning and activation of the translation machinery needs the 5´-terminal cap structure of the mRNA and an ATP-dependent scanning mechanism. However, an alternative way of translation initiation exists, called internal initiation. Some mRNAs are able to bypass cap binding, scanning and the necessity of some or even all eIFs by special structured sequences in their 5’-UTR, the internal ribosomal entry sites (IRESs). While cellular IRES containing mRNAs often code for important regulatory proteins, IRES elements of viruses are efficient tools to hijack the translational apparatus of their host cells. They are still functional, even if canonical translation initiation is impaired. The IRES element of the Hepatitis C Virus (HCV) and related viruses from the Flaviviridae family, such as the Classical Swine Fever Virus (CSFV), adopts a functionally important tertiary structure, that actively manipulates the eucaryotic ribosome. In this study we make use of the finding that in the presence of elevated Mg2+ and Ca2+ concentrations the HCV IRES allows total initiation factor-independent translation. This allows us to reconstitute and isolate eIF-free stable 80S • IRES complexes in vitro, suitable for cryo-EM. The cryo-EM map of a mammalian 80S ribosome in complex with the HCV IRES at significantly improved resolution of 7,8 Å is presented, enabling us for the first time to present a complete molecular tertiary structure model of the HCV IRES in its ribosome bound form. This model reveals a complex tertiary fold of the IRES RNA and molecular details of its interaction with the ribosome. The proteins rpS1e, rpS5e, rpS14e, rpS25, rpS26e, rpS27, rpS28e as well as Helices h23 and h26 of the 18S rRNA could be clearly identified as interaction partners in the head and platform region of the ribosomal 40S subunit. A structural Shine Dalgarno - anti Shine Dalgarno mimicry by the IRES is proposed. Aditionally, for the first time a cryo-EM map of a mammalian 80S ribosome in complex with the related CSFV IRES at a resolution of 10 Å is presented. Comparison with the HCV IRES complexes unterlines the high stuctural conservation of these mRNA signal structures.