Parasitological and molecular characterisation of isometamidium-sensitive and -resistant Trypanosoma congolense and T. brucei brucei isolates from cattle in East and West Africa

Abstract

Resistance to isometamidium is a serious problem in many parts of sub-Saharan Africa. Several tests have been described for the detection of drug resistance in trypanosomes, but the techniques currently used suffer from a number of drawbacks. Therefore, faster, more sensitive and more reliable methods are required. The main objectives of the current studies were a) assessing the isometamidium sensitivities of Trypanosoma congolense clones derived from trypanosome stocks from naturally infected cattle in East and West Africa, b) inducing isometamidium resistance in a drug sensitive T. congolense clone, and c) characterising the putatively resistance-related nucleoside transporter gene (TbAT1) in isometamidium-sensitive and -resistant T. brucei brucei and T. congolense. Trypanosome clones were derived from T. congolense stocks collected from cattle in Ethiopia and Burkina Faso with different isometamidium sensitivity phenotypes. An overall cloning success rate of 20.30% was achieved, which ranged from 16.67 to 25.00% for the different stocks. The isometamidium sensitivities of the clones were assessed to multiple dosages of isometamidium in mice. The results demonstrated that all the T. congolense clones expressed high levels of resistance to isometamidium when compared to known isometamidium-sensitive T. congolense reference clones. The clones from Burkina Faso expressed significantly (p<0.05) higher levels of resistance in mice than the clones from Ethiopia. Analyses of variances of the mean relapse intervals showed that for most of the clones tested there were clear relationships between the time of relapses and the doses of isometamidium used; mice treated with lower doses relapsed after a shorter time than mice treated with higher doses (p=0.001). The CD50 values for the clones from Ethiopia ranged from 9.86 to 13.37 mg/kg bw, whereas, the clones from Burkina Faso had CD50 values ranging from 19.80 to > 20.0 mg/kg bw. There was no significant (p>0.05) variation in expression of resistance to isometamidium among three of the clones derived from a single stock (PA 77) from Ethiopia. Similarly, two of the clones derived from a stock of Burkina Faso (SA 95) expressed a similar (p>0.05) level of resistance to isometamidium. With the aim of understanding the developmental mechanism of resistance in trypanosomes, clones of T. congolense with different level of resistance to isometamidium were derived from a drug sensitive clone in mice. The levels of resistance of IL 2642 clone to isometamidium was increased at least 159-fold (from a CD50 of 0.0086 to 1.37 mg/kg bw) by repeated subcurative treatment of infected mice over a period of 16 months. This was associated with 2.2-fold increase (from a CD50 of 8.20 to 18.02 mg/kg bw) in resistance to diminazene aceturate, tested in mice. The results indicate that administering drugs below effective levels can produce drug resistance. The high level of resistance developed in immunosuppressed mice in the current study was stable and persisted when the clones were subsequently tested in immunocompetent mice. However, similar drug doses and similar protocols in normal immunocompetent mice failed to lead to development of isometamidium resistance in the IL 2642 clone. This shows that immunosuppression of the host may considerably reduce the efficacy of trypanocidal drugs and can lead to the rapid development of drug resistance. Analyses were made on the TbAT1 gene, which encodes for the P2 transporter, from T. b. brucei field stocks to investigate a possible link between the presence of mutations in this gene and isometamidium resistance. We have analysed the TbAT1 gene of T. b. brucei from 11 isometamidium-sensitive field stocks, two sensitive reference clones and two resistant reference clones. Sequence alignment showed that the isometamidium-sensitive T. b. brucei contained the wild-type sequence patterns. In contrast, the isometamidium-resistant T. b. brucei stocks showed the mutant-type sequence patterns that corresponded to the DNA sequence of the laboratory-derived melarsoprol-resistant STIB 777R stock. Six point mutations were detected in the isometamidium-resistant stocks, which were also described earlier in the laboratory-derived melarsoprol-resistant stock of T. brucei. Four of these nucleotide differences detected lead to amino acid substitutions: Ala178 -&gt; Thr (A178T), Gly181-&gt; Glu (Gl181E), Asp239-&gt; Gly (D239G) and Asn286-&gt; Ser (N286S). Furthermore, deletions of three nucleotides (TTC) that encode the amino acid phenylalanine were detected in the resistant stocks. The point mutation that led to the substitution of G by A at nucleotide position 532 (G532A) in the sensitive stock eliminated the Sfa NI restriction site. Whereas, the mutation at 857 bp that led to the substitution of A by G (A857G) generated a new Sfa NI restriction site. Consequently, in order to analyse the RFLP pattern of a fragment of TbAT1 (nucleotides 430-1108), the 677 bp PCR products from eight of the isometamidium-sensitive and two of the isometamidium-resistant T. b. brucei were subjected to digestion with Sfa NI. The results revealed two different banding patterns: the digest produced fragment sizes of 566 and 111 bp in the case of TbAT1 from isometamidium-sensitive stocks, whereas it produced fragment sizes of 435 and 242 bp in the case of TbAT1 from isometamidium- resistant stocks. Thus, the isometamidium-sensitive and resistant T. b. brucei could be successfully distinguished by digestion with the restriction endonuclease Sfa NI. It can therefore be concluded that there is a link between the presence of mutations in the nucleotide transporter gene (TbAT1) in T. b. brucei and isometamidium resistance. Furthermore, Sfa NI-RFLP, if validated with a large scale screening of field isolates, may serve as a convenient diagnostic tool for rapid identification of isometamidium-resistant T. b. brucei. The attempts made to amplify the TbAT1 homologous gene from the genomic DNA of T. congolense failed.

Die Resistenz gegen Isometamidium ist in vielen südlich der Sahara gelegenen Regionen Afrikas ein ernstzunehmendes Problem. Zum Nachweis von Arzneimittel- Resistenz bei Trypanosomen sind mehrere Methoden beschrieben worden, allerdings haben die zurzeit angewendeten Techniken eine Reihe von Nachteilen. Daher ist der Bedarf an sensitiveren und verlässlicheren Methoden groß. Ziel der Studie war a) die Prüfung der Isometamidium Empfindlichkeit von Trypanosoma congolense Klonen, die aus Populationen von natürlich infizierten Rindern aus West- und Ostafrika stammten, b) die Resistenz gegen Isometamidium in einem sensiblen T. congolense Klon zu erzeugen und c) die Charakterisierung des vermutlich Resistenzabhängigen Nukleosid Transportgens (TbAT1) in Isometamidium-sensiblen und resistenten T. brucei brucei und T. congolense. Die Trypanosomen Klone stammen von T. congolense Populationen von Rindern aus Äthiopien und Burkina Faso, die unterschiedliche Phänotypen bezüglich Isometamidium-Sensibilität aufwiesen. Insgesamt lag der Klonierungserfolg bei 20.3%, der bei den einzelnen Populationen von 16,67% bis 25,0% schwankte. Die Sensibilität der Klone gegen Isometamidium wurde mittels Dosierungsversuchen an Mäusen erprobt. Es zeigte sich, dass alle T. congolense Klone im Vergleich mit den sicher Isometamidium-sensiblen Referenzstämmen einen hohen Grad an Resistenz gegen Isometamidium aufwiesen. Die Klone aus Burkina Faso zeigten in Mäusen signifikant (p<0,05) stärkere Resistenz als die Klone aus Äthiopien. Mittels einer Varianzanalyse der mittleren Intervallzeiten bis zum Rückfall der Mäuse konnte bei den meisten getesteten Klonen ein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Zeitpunkt des Rückfalls und der verwendeten Isometamidium Dosierung gezeigt werden; die Mäuse, die mit einer niedrigeren Dosierung behandelt worden waren, erlitten früher einen Rückfall, als die, die eine höhere Dosis erhielten (p=0.001). Die CD50-Werte der äthiopischen Klone lagen im Bereich von 9,86 bis 13,37 mg/Kg KGW während die Klone aus Burkina Faso CD50-Werte von 19,80 bis > 20,0 mg/Kg KGW aufwiesen. Innerhalb von drei Klonen aus einer äthiopischen Population (PA 77) zeigten sich keine signifikanten Unterschiede im Resistenzgrad. Ebenso ähnelte sich die Ausprägung von Isometamidium Resistenz zweier Klone aus einer Population von Burkina Faso (p> 0,05). Um die Entwicklung des Resistenzmechanismus bei Trypanosomen besser zu verstehen, wurden mehrere T. congolense Klone mit unterschiedlichem Resistenzniveau aus einem Isometamidium-sensiblen Klon in der Maus gewonnen. Durch wiederholte Behandlung mit subtherapeutischer Dosierung über einen Zeitraum von 16 Monaten wurden der Resistenzgrad von Klon IL 2642 um mindestens das 159-fache gesteigert (von CD50= 0,0086 auf 1,37 mg/kg KGW). Dies war verbunden mit einem 2,2 fachen Anstieg einer an Mäusen getesteten Diminazen-Resistenz (von CD50= 8,20 auf 18,2 mg/Kg KGW). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit einer Verabreichung subtherapeutischer Dosierung Resistenzen gegen Medikamente hervorgerufen werden können. Der hier in immunsupprimierten Mäusen erzeugte hohe Resistenzgrad war stabil und erwies sich auch bei im Folgenden mit diesen Klonen infizierten immunkompetenten Mäusen als dauerhaft. Allerdings konnte mit ähnlichem Dosierungsschema und Studienprotokoll bei normalen immunkompetenten Mäusen keine Isometamidium- Resistenz bei dem Klon IL 2642 hervorgerufen werden. Dies zeigt, dass eine Immunsuppression des Wirts die Wirksamkeit von trypanoziden Wirkstoffen beträchtlich herabsetzen und so zu einer schnellen Entwicklung von Resistenz beitragen kann. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Genmutationen und Isometamidium-Resistenz zu finden, wurde das TbAT1 Gen des T. b. brucei Feldstammes analysiert, welches für den P2 Transporter kodiert. Insgesamt wurde das TbAT1 Gen von T. b. brucei von 11 Isometamidium-sensiblen Feldstämmen sowie von zwei sensiblen und zwei resistenten Referenzklonen analysiert. Im Sequenzvergleich zeigte der Isometamidium-sensible Stamm von T. b. brucei das Sequenzmuster des Wildtyps. Im Gegensatz dazu wies der Isometamidium-resistente Stamm von T. b .brucei ein mutiertes Sequenzmuster auf, welches mit der DNA Sequenz des experimentell gewonnenen Melarsoprol- resistenten Stammes STIB 777R übereinstimmte. In diesen Isometamidium- resistenten Stämmen konnten sechs Punktmutationen nachgewiesen werden, die auch schon bei dem experimentell gewonnenen Melarsoprol-resistenten Stamm STIB 777R gefunden worden waren. Vier dieser Nukleotid-Unterschiede führten zum Austausch einer Aminosäure: Ala178 -&gt; Thr (A178T), Gly181 -&gt; Glu (Gl181E), Asp239 -&gt; Gly (D239G) und Asn286 -&gt; Ser (N286S). Des Weiteren wurden bei den resistenten Stämmen drei Nukleotid-Deletionen (TTC) entdeckt, die für die Aminosäure Phenylalanin kodieren. Die Punktmutation, die im sensiblen Stamm an der Position 532 (G532A) zu einem Austausch von G durch A führte, zerstörte so die Schnittstelle für das Enzym Sfa NI. Im Gegensatz dazu generierte die Punktmutation an Position 857 bp, welche den Austausch von A durch G (A857G) verursachte, eine neue Schnittstelle für das Enzym Sfa NI. Im Folgenden wurden die 677 bp-großen PCR-Produkte von acht der Isometamidium- sensiblen und von zwei der Isometamidium-resistenten T. b. brucei mit Sfa NI verdaut, um das RFLP Muster des Fragments von TbAT1 (Nukleotid 430-1108) zu analysieren. Das Ergebnis enthüllte zwei verschiedene Bandmuster: Bei TbAT1 von Isometamidium-sensiblen Stämen ergab der Verdau Fragmente von 566 bp und 111 bp, während die Fragmente bei TbAT1 von Isometamidium-resistenten Stämmen bei 435 und 242 lagen. Demzufolge konnten Isometamidium-sensible und Isometamidium-resistente Stämme von T. b. brucei erfolgreich durch eine Restriktionsverdau mit Sfa Ni unterschieden werden. Daraus kann geschlossen werden, dass es einen Zusammenhang zwischen der Präsenz von Punktmutationen im Nukleotid Transportergen (TbAT1) von T. b. brucei und dem Auftreten von Isometamidium-Resistenz gibt. Des Weiteren ist der RFLP von Sfa NI nach einer Validierung mittels umfangreicher Untersuchungen von Feldisolaten möglicherweise eine geeignete Methode für eine schnelle Diagnose von Isometamidium-resistenten T. b. brucei. Der Versuch, das homologe TbAT1-Gen von T. congolense zu amplifizieren, blieb erfolglos.