Crosstalk between cholangiocytes and liver macrophages upon liver injury

Abstract

Background Liver diseases lead to more than two million deaths yearly worldwide, accounting for 4% of global deaths. Upon liver injury, cholangiocytes may promote ductular reaction (DR) by acquiring migratory properties and a de-differentiated phenotype. Notably, DR has been considered as an essential hallmark in a variety of liver diseases. Furthermore, reactive cholangiocyte-released mediators (termed cholangiokines) have been characterized to play major roles in portal fibrogenesis and to regulate cellular crosstalk in the portal area niche. The present work aimed at elucidating cellular crosstalk between cholangiocytes and macrophages upon liver injury as well as their potential relevance in liver disease progression. Methods To explore the key cell communication mediators released by cholangiocytes during liver injury, bioinformatics analysis was conducted on publicly available and our own transcriptome datasets. Immunohistochemistry and immunocytochemistry were performed to evaluate the distribution and protein levels of the candidates. Multiple mouse strains’ (wild-type, Mdr2-/-, Act CFP and Act DsRed) liver and blood as well as healthy human blood samples were collected for primary cell isolation and co-culture experiments. Recombinant mouse and human Orosomucoid 2 (ORM2), biliatresone and bile acids were used for in vitro stimulation. Cell phenotypic marker expression and cytokine release were measured by flow cytometry. Bulk RNA sequencing was performed on mouse liver macrophages to reveal transcriptome alterations. Small-interfering RNA transfection was used to knock down Orm2 or Itpr2 expression in cholangiocytes. Results ORM2 was screened out to be one of the most strongly induced secretory factors expressed by mouse-derived intrahepatic cholangiocytes under acute bile duct injury. Accordingly, cholangiocytes exhibited a strong upregulation of Orm2 upon in vitro stimulation. Furthermore, ORM2 induced monocyte recruitment and profound transcriptome alterations in liver macrophages, associated with the increase of pro-inflammatory cytokine secretion and expression of cell stress-related genes. Furthermore, ORM2-activated macrophages exacerbated cell stress and Orm2 expression in both cholangiocytes and hepatocytes and promoted fibrogenesis in hepatic stellate cells. Finally, mechanistic experiments determined that ORM2 regulated liver macrophage functions via an ITPR2-dependent calcium pathway. Conclusions This study demonstrates that cholangiocyte-derived ORM2 induces liver macrophage reprogramming via an ITPR2-dependent calcium pathway in response to acute and chronic biliary injury, mediating a remodeling of the immune biliary niche.

Hintergrund Lebererkrankungen verursachen weltweit mehr als zwei Millionen Todesfälle pro Jahr, was 4 % der weltweiten Todesfälle entspricht. Nach einer Leberverletzung können Cholangiozyten die duktuläre Reaktion (DR) fördern, indem sie wandernde Eigenschaften und einen entdifferenzierten Phänotyp annehmen. Die Die DR ist ein wesentliches Merkmal bei einer Vielzahl von Lebererkrankungen. Kürzlich wurde festgestellt, dass reaktive, von Cholangiozyten freigesetzte Mediatoren (so genannte Cholangiokine) eine wichtige Rolle bei der portalen Fibrogenese spielen und den zellulären Crosstalk in der Nische des Portalbereichs regulieren. Daher zielt die vorliegende Arbeit darauf ab, den zellulären Crosstalk zwischen Cholangiozyten und Makrophagen bei Leberschädigung und deren potenzielle Relevanz für die Leber aufzuschlüsseln. Methoden Um den Schlüsselfaktor zu untersuchen, wurde eine bioinformatische Analyse öffentlich zugänglicher und firmeneigener Transkriptom-Datensätze durchgeführt. Immunhistochemie und Immunzytochemie wurden durchgeführt, um die Verteilung der Zellen und ihrer Marker zu verstehen. Mehrere Mausstämme (Wildtyp, Mdr2-/-, Act CFP und Act DsRed), Leber- und Blutproben sowie gesundes menschliches Blut wurden für primäre Zellisolierungs- und Co-Kulturexperimente gesammelt. Für die In-vitro-Stimulation wurden rekombinantes Orosomucoid 2 (ORM2) von Maus und Mensch, Biliatreson und Gallensäuren verwendet. Die Expression phänotypischer Marker und die Zytokinfreisetzung wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen. An Mäuselebermakrophagen wurde eine Massen-RNA-Sequenzierung durchgeführt, um Transkriptomveränderungen aufzudecken. Die Expression von Orm2 oder Itpr2 in Cholangiozyten wurde durch Small-Interfering-RNA-Transfektion ausgeschaltet. Ergebnisse ORM2 erwies sich als einer der am stärksten induzierten sekretorischen Faktoren, die von intrahepatischen Cholangiozyten der Maus bei akuter Verletzung der Gallenwege exprimiert werden. Dementsprechend zeigten die Cholangiozyten eine starke Hochregulierung von Orm2 bei In-vitro-Stimulation. Darüber hinaus induzierte ORM2 die Rekrutierung von Monozyten und starke Transkriptomveränderungen in Lebermakrophagen, die mit erhöhten Sekretion proinflammatorischer Zytokine und Expression zellstressbezogener Gene einhergingen. Darüber hinaus verstärkten ORM2-aktivierte Makrophagen den Zellstress und die Expression von Orm2 sowohl in Cholangiozyten als auch in Hepatozyten und förderten die Fibrogenese in hepatischen Sternzellen. Schließlich wurde in mechanistischen Experimenten festgestellt, dass ORM2 die Funktionen der Lebermakrophagen über einen ITPR2-abhängigen Kalziumweg reguliert. Schlussfolgerungen Diese Studie zeigt, dass ORM2 aus Cholangiozyten infolge akuter und chronischer Gallengangsschädigungen eine Umprogrammierung von Lebermakrophagen auslöst, die über einen ITPR2-abhängigen Kalziumweg vermittelt wird, und somit eine Umgestaltung der biliären Immunzell-Nische herbeiführt.