Pharmakodynamische und pharmakokinetische Untersuchungen von Glucocorticoiden und Charakterisierung Nanopartikulärer Trägersysteme

Abstract

Trotz der kürzlichen Einführung von Tacrolimus und Pimecrolimus in die Therapie des atopischen Ekzems stellen topisch applizierte Glucocorticoide (GC) aufgrund ihrer starken antiinflammatorischen Eigenschaften und der langen Therapieerfahrung nach wie vor Mittel der Wahl dar. Die Atrophogenität schränkt den Einsatz dieser Arzneistoffe jedoch ein. Um eine Nutzen-Risiko- Relation zu erstellen, sollte ein breites Spektrum von GC getestet und die pharmakodynamischen Effekte mit Rezeptorbindungsdaten korreliert werden. Keratinozyten und Fibroblasten dienten als Modell für die Untersuchung der Wirkung an der Haut. Mit Hilfe des Proliferationsassays konnten für beide Zelltypen IC50-Werte ermittelt werden. Hierbei war insbesondere der antiproliferative Effekt auf Fibroblasten von Interesse, da dieser als Parameter für das Atrophierisiko gilt. Anfänglich wurde angenommen, dass die Atrophie durch Induktion von Apoptose vermittelt wird, doch wirkten GC in therapeutisch relevanten Konzentrationen nicht apoptotisch. Im Gegenteil, GC schützten Fibroblasten sogar vor der durch TNFα/Act induzierten Apoptose und erhöhten die Bildung von Sphingosin-1-Phosphat (S1P), das selbst antiapoptotisch wirkt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass GC ihre zytoprotektive Wirkung über den S1P3 Rezeptorsubtyp vermitteln, wie mit Hilfe von S1P3 KO Fibroblasten gezeigt wurde. Darüber hinaus konnte auch für das S1P Analogon FTY720P eine antiapoptotische Wirkung nachgewiesen werden, die ebenfalls über den S1P3 Rezeptor vermittelt wird. Da zwischen Proliferationshemmung und Rezeptorbindung keine Korrelation gefunden wurde, ist anzunehmen, dass sich die topischen GC bezüglich der Nutzen-Risiko- Relation nicht durch die Beeinflussung von Proliferation, sondern vielmehr durch ihre Kinetik unterscheiden. Aus diesem Grund könnten nanopartikuläre Trägersysteme, konkret Solid Lipid Nanoparticles (SLN), Nanostructured Lipid Carriers (NLC) und Nanoemulsion (NE), die Nutzen-Risiko-Relation weiter verbessern, sofern ein epidermales Targeting erreicht wird. Dazu muss der Arzneistoff an die Partikeloberfläche assoziiert vorliegen. Dies war mit SLN für einzelne Substanzen möglich, nicht aber für NLC oder NE. Die Charakterisierung der nanopartikulären Träger erfolgte mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), der Parelektrischen Spektroskopie (PS) und der Elektronen-Spin-Resonanz (ESR) unter Verwendung einer spingelabelten Cholestansonde, die Strukturähnlichkeit zu den GC aufweist. Mit Hilfe der TEM wurde die Partikelform von SLN, NLC und NE aufgeklärt. SLN und NLC waren von plättchenförmiger Struktur, das flüssige Lipid ist bei den NLC an die Oberfläche der Plättchen aufgelagert. Bei der NE handelt es sich um kugelförmige Lipidtröpfchen. Bei SLN befindet sich die Spinsonde auf der Oberfläche des festen Lipids. Erstmals wurden mit Hilfe der ESR bei SLN zwei Subkompartimente identifiziert, die sich in ihren Korrelationszeiten unterscheiden. Ein Teil der Sonde befindet sich auf der planen Oberfläche, der andere Teil im Randbereich der SLN. Bei der NE ist die Sonde vollständig, bei NLC zum größten Teil in das flüssige Lipid (Miglyol) eingeschlossen. Die Ergebnisse zeigen die Bedeutung der Pharmakokinetik für die Beeinflussung und Verbesserung der Nutzen-Risiko-Relation, SLN erscheinen wegen des epidermalen Targeting-Effekts besonders interessant. Die Charakterisierung dieser Trägersysteme, insbesondere der SLN, gibt neue Einblicke in die Modellstoff- Träger Interaktion. Unterschiedliche Verteilungen eines Arzneistoffs in den bei den SLN gefundenen Subkompartimenten könnten für den Targetingeffekt und das Penetrationsverhalten von entscheidender Bedeutung sein.

In spite of the recent introduction of tacrolimus and pimecrolimus into the therapy of atopic dermatitis, topical applied glucocorticoids (GC) are still first line treatment because of their strong anti-inflammatory properties and the long term experience in therapy with these substances. However, skin atrophy caused by GC restricts their applicability. In order to establish a benefit/risk ratio, a broad spectrum of GC was evaluated and pharmacodynamic effects should be correlated with receptor binding data. Keratinocytes and fibroblasts served as skin model. By means of the proliferation assay it was possible to determine IC50 values for both cell types. The antiproliferative effect on fibroblasts was of special interest as it is regarded as a parameter for skin atrophy. Initially we tested the hypothesis that this effect was mediated by induction of apoptosis by GC. Yet, in therapeutically relevant concentrations GC failed to induce apoptosis. In contrast, GC even protect fibroblasts from apoptosis induced by TNFα/Act and augment the synthesis of sphingosine-1-phosphate (S1P), which itself acts anti-apoptotic. In the course of this work it was found that GC mediate their cytoprotective effect via the S1P3 receptor subtype as it was demonstrated with S1P3 KO fibroblasts. Moreover, also for the S1P analogue FTY720P an anti-apoptotic effect could be demonstrated, which was also mediated via the S1P3 receptor. As no correlation was found between inhibition of proliferation and receptor binding we conclude that for differences in benefit/risk ratio of topically applied GC the influences on viability and proliferation are less relevant as compared to differences in their kinetics. For this reason nanoparticular carrier systems, like Solid Lipid Nanoparticles (SLN), Nanostructured Lipid Carriers (NLC) and Nanoemulsion (NE) will allow further improvement of the benefit/risk ratio if an epidermal targeting is achieved. Therefore the drug substance must be associated to the surface of the particle. This was possible for a few substances with SLN; however, it was not possible for NLC or NE. The characterization of the nanoparticular carriers was achieved by means of Transmissionelectronmicroscopy (TEM), Parelectric Spectroscopy (PS) and Electron-Spin-Resonance (ESR) by using a labeled cholestane probe which showed structural similarity to GC. By means of TEM the shape of the particles of SLN, NLC and NE could be elucidated. For the lipids used in this work disc- like structures were found for SLN as well as for NLC. With NLC the liquid lipid is associated onto the surface of the disc-shaped structure. For NE spherical lipid structures were found. With SLN the spin probe is located on the surface of the solid lipid. For the first time two sub-compartments were detected. One part of the probe is located on the planar surface whereas the other part is located in the rim area of SLN. With NE, the probe is completely and, with NLC still to a great extend, embedded in the liquid lipid (Miglyol). The results of this work clearly demonstrate the importance of pharmacokinetics for the impact and the enhancement of the benefit/risk ratio of GC. In this context SLN achieved particular importance because of their epidermal targeting effects. The characterization of these carrier systems, especially of SLN, provides new insights into the interaction of model substance and carrier. Distinctive distribution of a drug substance in the two sub-compartments found for SLN could be of particular importance for targeting effects and penetration characteristics.