Diverse regulatory functions of long non-coding RNAs

Abstract

Long non-coding RNAs (ncRNAs) control almost every level of the gene expression program adding an unexpected layer of complexity in the regulation of gene expression. They have been shown to control fundamental biological processes such as X chromosome inactivation, imprinting, proliferation, development and differentiation. Furthermore, they are involved in the development of a wide variety of human disorders such as cancer and neurodegenerative disorders. Recent research revealed that some long ncRNAs are expressed from a subset of enhancers and are required for mediating their function. However, the extent to which long ncRNAs are required for enhancer function is still unknown. Additionally, although enhancers have been studied for decades, there is still no consensus on how to predict tissue-specific enhancers. In this thesis we employed a recently developed methodology- PreSTIGE to predict tissue specific enhancers and their targets based on the tissue specific presence of H3K4me1 marks and tissue specific gene expression. We find that 28 % (2,695) of all ENCODE annotated long ncRNAs overlap tissue- specific enhancers predicted by PreSTIGE. The expression of enhancer overlapping long ncRNAs is significantly higher in a tissue in which an overlapping enhancer is predicted to be active suggesting that some enhancers might require long ncRNAs for their activity. This dependency for long ncRNA expression is not observed at enhancers predicted by a different methodology. Additionally, we find that enhancers expressing long ncRNAs have a lower H3K4me1/H3K4me3 ratio suggesting that they might have a specific epigenetic profile. In summary, we verify the tissue-specific predictive power of PreSTIGE and demonstrate that almost one third of long ncRNAs are expressed from tissue-specific enhancers suggesting that the interplay between long ncRNAs and enhancers is important for regulation of tissue-specific gene expression. Although we are able to detect thousands of long ncRNAs due to the technological progress identifying functional long ncRNAs and functional characterization of these low abundant transcripts is still challenging. By using functional data for differential expression of long ncRNAs in differentiating keratinocytes and RNA polymerase II association, we identified PARROT, a functional long ncRNA expressed at a relatively high level in HeLa cells. Genome wide transcriptome and proteome analysis upon depletion of PARROT revealed that PARROT acts as an upstream regulator of c-Myc affecting cellular proliferation, migration and translation. Furthermore, we find that PARROT is down-regulated in senescence and up-regulated in some cancers further suggesting that PARROT has an important role in the regulation of cellular proliferation.

Lange nicht-kodierende RNAs (ncRNAs) kontrollieren nahezu jede Ebene des Genexpressionsprogramms und fügen diesem eine unerwartete Komplexität hinzu. NcRNAs kontrollieren fundamentale biologische Prozesse wie z.B. X-Chromosom- Inaktivierung, Imprinting, Zellteilung, Entwicklung und Differenzierung. Zusätzlich sind sie involviert in der Entstehung einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten wie Krebs oder neurodegenerative Erkrankungen. Jüngste Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass einige lange ncRNAs von einer Teilmenge der Enhancerelemente im menschlichen Genom exprimiert werden und notwendig sind um die Enhancerfunktion zu vermitteln. Dennoch sind das Ausmaß zu welchem lange ncRNAs für die Enhancerfunktion benötigt werden noch nicht bekannt. Zusätzlich besteht bisher kein Konsens darüber wie Gewebs-spezifische Enhancer vorher gesagt werden sollten obwohl Enhancer bereits seit Jahrzehnten erforscht werden. In dieser Doktorarbeit verwenden wir eine kürzlich entwickelte Methode – PreSTIGE – um Gewebs-spezifische Enhancer sowie ihre Zielgene vorherzusagen. Diese Methode basiert auf dem Gewebs-spezifischen Vorhandensein von Histonmethylierungen, im speziellen H3K4me1, sowie der Gewebs-spezifischen Genexpression. Dabei finden wir, dass 28% (2.695) aller ENCODE annotierten langen ncRNAs mit Gewebs-spezifischen Enhancern überlappen, die als solche durch PreSTIGE vorhergesagt werden. Die Expression von solchen langen ncRNAs, die mit Enhancern überlappen, ist signifikant höher im jeweiligen Gewebe in dem der entsprechende Enhancer vorhergesagt wird aktiv zu sein. Dies deutet darauf hin, dass einige Enhancer die Expression von langen ncRNAs zur Ausführung ihrer Enhancerfunktion benötigen. Diese Abhängigkeit zur gleichzeitigen Expression von langen ncRNAs wird nicht beobachtet an Enhancern, die mittels einer anderen Methode vorausgesagt werden. Zusätzlich finden wir, dass Enhancer, die eine lange ncRNA exprimieren, ein geringeres Verhältnis von H3K4me1/H3K4me3 Histonmodifikationen aufweisen, was darauf hindeutet, dass sie ein spezifisches epigenetisches Profil aufweisen könnten. Zusammenfassend weisen wir die Gewebs- spezifische Vorhersagekraft von Enhancern durch PreSTIGE nach und zeigen außerdem, dass fast ein Drittel aller annotierten long ncRNAs von Gewebs- spezifischen Enhancern transkribiert werden. Dies deutet darauf hin, dass das Zusammenspiel von langen ncRNAs und Enhancern wichtig ist für die Regulation von Gewebs-spezifischer Genexpression. Trotz des technologischen Fortschritts tausende lange ncRNAs zu detektieren, ist die Identifizierung funktionaler langer ncRNAs sowie die funktionelle Charakterisierung dieser gering exprimierten Transkripte anspruchsvoll. Mittels Verwendung funktioneller Daten für die differentielle Expression von langen ncRNAs in differenzierenden Keratinocyten und deren Assoziation mit RNA Polymerase II, identifizieren wir PARROT, eine funktionale lange ncRNA, die zu relativ hohen Leveln in HeLa Zellen exprimiert ist. Genomweite Transkriptom- und Proteomanalyse im Anschluss an den knock-down von PARROT zeigte, dass PARROT als ein vorgeschalteter Regulator von c-Myc fungiert und aufgrund dessen Zellteilung, Migration und Translation in HeLa Zellen beeinflusst. Weiterhin beobachten wir, dass die Expression von PARROT herunterreguliert ist während zellulärer Seneszenz und heraufreguliert ist in einigen Krebsarten. Damit könnte PARROT eine wichtige Rolle in der Regulation der zellulären Proliferation zugeschrieben werden.