PLPPR3 facilitates cytoskeleton-membrane interactions by condensate formation

Abstract

Neuronal branching is a developmental program, by which neurons acquire their complex morphologies. This highly dynamic process relies on various signaling molecules, cues and proteins such as the phospholipid-phosphatase related protein (PLPPR) family. PLPPR3, a family member of PLPPRs, is a transmembrane protein with a long intracellular domain (ICD) that primarily localizes to the axonal plasma membrane. Previous work demonstrated that PLPPR3 is highly expressed during neuronal development and can induce axonal filopodia. Prior to my project, no work had described a conclusive model of PLPPR3 ICD-facilitated filopodia formation. The work presented here, establishes the purification of intracellular domain of PLPPR3 (Chapter 1). I gathered evidence that PLPPR3 ICD is a highly disordered protein domain utilizing circular dichroism spectroscopy and limited proteolysis (Chapter 2). Using in vitro assays, I showed that PLPPR3 ICD undergoes liquid-liquid phase separation (LLPS) (Chapter 3). LLPS is an interaction-driven process that orchestrates intrinsically disordered regions to form condensates, which serve as membrane less reaction compartments. PLPPR3 ICD condensates, follow liquid-like properties of phase separating proteins such as coalescence, fusion and circularity. With help of a blue-light inducible optogenetic PLPPR3 ICD CRY2 fusion construct, I was able to validated these properties in cells. To identify driving regions of PLPPR3 ICD LLPS, I utilized various deletion constructs and narrowed down the region to the membrane distal part of the protein. I further conceptualize a model of PLPPR3 ICD-facilitated filopodia formation in vitro (Chapter 4). I provide evidence that PLPPR3 ICD condensates can reshape giant unilamellar vesicle (GUV) membranes, by attracting PLPPR3 ICD condensates to the GUV interface. Using fluorescence microscopy, I demonstrate that PLPPR3 ICD condensates co-partion actin monomers and serve as actin nucleating compartments. Hence, I exhibit ring-shaped F-actin structures that polymerize out of PLPPR3 ICD condensates. I revealed that the formation of ring-shaped F-actin structures depends on the formation of PLPPR3 ICD condensate, while the polymerization from the condensates depend on the local actin concentration. In summary, the presented work showed that PLPPR3 ICD forms liquid-like condensates, which nucleate actin. Considering PLPPR3s proven function to induce filopodia, this thesis provides a compelling model mechanism of PLPPR3 ICD condensates facilitating filopodia formation.

Die Verzweigung von Neuronen ist ein Entwicklungsprogramm, durch das Neuronen ihre komplexe Morphologie erhalten. Dieser hochdynamische Prozess hängt von verschiedenen Signalmolekülen, Stimuli und Proteinen wie der Familie der Phospholipid-Phosphatase-verwandten Proteine (PLPPR) ab. PLPPR3, ein Mitglied der PLPPR-Familie, ist ein Transmembranprotein mit einer langen intrazellulären Domäne (ICD), das hauptsächlich an der axonalen Plasmamembran lokalisiert ist. Die durchgeführten Arbeiten haben gezeigt, dass PLPPR3 während der neuronalen Entwicklung stark exprimiert wird und axonale Filopodien ausbilden kann. Vor meinem Projekt gab es keine Arbeit, die ein schlüssiges Modell für die Filopodienbildung durch PLPPR3 ICD beschrieben hat. In dieser Arbeit wurde die Reinigung der intrazellulären Domäne von PLPPR3 etabliert (Kapitel 1). Mit Hilfe von Zirkulardichroismus-Spektroskopie und limitierter Proteolyse konnte ich nachweisen, dass PLPPR3 ICD eine hochgradig ungeordnete Proteindomäne ist (Kapitel 2). Mithilfe von in-vitro Experimenten, habe ich gezeigt, dass PLPPR3 ICD eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) durchläuft (Kapitel 3). LLPS ist ein interaktionsgesteuerter Prozess, der intrinsisch ungeordnete Regionen zur Bildung von Kondensaten bildet, die als membranlose Reaktionskompartimente dienen. Die PLPPR3 ICD Kondensate besitzen flüssigkeitsähnliche Eigenschaften von phasentrennenden Proteinen, wie Koaleszenz, Fusion und Zirkularität. Mit Hilfe eines durch blaues Licht induzierbaren, optogenetischen PLPPR3 ICD CRY2 Fusionskonstruktes, konnte ich diese Eigenschaften zusätzlich in Zellen validieren. Durch diverse Deletionskonstrukte, konnte ich die verantwortlichen LLPS Regionen von PLPPR3 ICD auf den membranfernen Teil des Proteins eingrenzen. Darüber hinaus habe ich ein Modell, der PLPPR3 ICD unterstützten Filopodienbildung in vitro, konzipiert (Kapitel 4). Ich konnte zeigen, dass PLPPR3 ICD Kondensate die Membranen von riesigen unilamellaren Vesikeln (GUV) umgestalten können, indem PLPPR3 ICD Kondensate an die GUV-Grenzfläche binden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie zeige ich, dass PLPPR3 ICD Kondensate Aktinmonomere ko-partionieren und als Aktin-Nukleierungskompartimente dienen. Dadurch bilden sich ringförmige F-Aktin-Strukturen, die aus PLPPR3 ICD Kondensaten polymerisieren. Ich konnte feststellen, dass die Bildung ringförmiger F-Aktin-Strukturen von der Bildung von PLPPR3 ICD Kondensaten abhängt, während die Polymerisation aus den Kondensaten von der lokalen Aktinkonzentration abhängt. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass PLPPR3 ICD flüssigkeitsähnliche Kondensate bildet, die Aktin nukleieren können. In Anbetracht der nachgewiesenen Funktion von PLPPR3 bei der Induktion von Filopodien, liefert diese Arbeit einen neuen Modellmechanismus für die Rolle von PLPPR3 ICD Kondensaten bei der Bildung von Filopodien