Adaptation und Validierung der Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsrate in Geweben und deren Einsatz zur Evaluation metabolischer Stressoren

Abstract

Hintergrund: Mitochondrien sind überlebenswichtige Zellorganellen, die nicht nur für die Steuerung der zellulären Energieproduktion zuständig sind, sondern auch eine wichtige Bedeutung für diverse Prozesse wie Zellwachstum, Kontrolle des Zellzyklus und Zelltod haben. Veränderungen der mitochondrialen Funktion bis hin zur mitochondrialen Dysfunktion stehen im Zusammenhang mit diversen Krankheitsbildern wie Adipositas, Diabetes mellitus, nicht-alkoholischer Fettlebererkrankung (NAFLD), nicht-alkoholischer Steatohepatitis (NASH), Arteriosklerose und verschiedenen Krebserkrankungen. Das Verständnis und die Bestimmung der mitochondrialen Funktion ist daher von großem Interesse. Generell sind Messungen der mitochondrialen Funktion in isolierten Zellen und Mitochondrien möglich. Isolationsprozesse und anschließende Kulturbedingungen führen jedoch bislang zu erheblichen (metabolischen) Veränderungen. Ziel der vorliegenden Dissertation war es daher, die mitochondriale Funktion im Gewebe als Ganzes und nicht in isolierten Zellen bestimmen zu können, ohne methodenbedingt signifikante metabolische Veränderungen zu induzieren. Diese würde ein unverfälschteres Abbild der mitochondrialen Funktion erlauben.

Methoden: Um die mitochondriale Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in Gewebebiopsien ex vivo bestimmen zu können, wurden Etablierungsschritte wie Evaluierung unterschiedlicher Biopsiestanzgrößen, Produktion von Mikrosieben mittels 3D-Druck, Titration von Inhibitoren, Anpassung der Versuchsdauer und Messzeiten sowie Versuche zur Testung der Reproduzierbarkeit und Robustheit durchgeführt. Die Messungen wurden für Leber, (weißes und braunes) Fettgewebe, Herz sowie Pankreas an murinen Gewebeproben etabliert und verifiziert. Anschließend wurde der Einfluss einer zwölfwöchigen Hochfett- (HFD), Hochzucker- (HSD) und Westerndiät (WD) in jungen Mäusen, einer HFD in gealterten Mäusen, zweijähriges Altern sowie nächtliches Fasten auf die OCR der unterschiedlichen Organe untersucht. Zur erweiterten Charakterisierung der mitochondrialen Funktion wurden zusätzliche Methoden wie Western Blot Analysen sowie Elektronenmikroskopie hinzugezogen.

Ergebnisse: Es konnte erfolgreich eine neue ex vivo Methode zur Bestimmung der mitochondrialen OCR in murinen Gewebebiopsien etabliert werden. Diese eröffnete die Möglichkeit, den Einfluss von metabolischem Stress, induziert durch Ernährung, Altern und Fasten, auf die OCR zu untersuchen. Eine dreimonatige Diätenintervention in jungem Alter zeigte geringe Effekte auf die mitochondriale Atmung, führte jedoch zu einer Reduktion der Atmungskettenkomplexe II und IV im Fettgewebe. Im Gegensatz dazu, wiesen gealterte Mäuse, die einer HFD ausgesetzt waren, eine reduzierte hepatische metabolische Flexibilität auf und zeigten eine gesteigerte OCR in weißem (eWAT) und braunen Fettgewebe (BAT). Die Reduktion der hepatischen metabolischen Flexibilität konnte durch prolongiertes Altern ohne zusätzlichen metabolischen Stress nicht beobachtet werden. Stattdessen führte prolongiertes Altern zu einem Anstieg der OCR im braunen Fettgewebe (BAT). Der Stressor Fasten induzierte einen Anstieg der OCR in Leber- und Pankreasgewebe und reduzierte das Gewicht dieser beiden Organe.

Schlussfolgerung: Mithilfe der etablierten ex vivo Messungen war es möglich, die mitochondriale Funktion von Leber, braunem und weißen Fettgewebe, Pankreas und Herz umfassend zu bestimmen und die Auswirkungen der metabolischen Stressoren zu analysieren.

Background: Mitochondria are pivotal cellular organelles that are not only responsible for controlling cellular energy production, but also play an important role in various processes such as cell growth, cell cycle control and cell death. Alterations in mitochondrial function up to mitochondrial dysfunction are associated with diverse disease patterns such as obesity, diabetes mellitus, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), atherosclerosis and a variety of malignancies. Thus, the assessment and comprehension of mitochondrial function assume paramount importance. Measurements of mitochondrial function have been conducted so far within isolated cells and mitochondria. However, isolation processes and subsequent culture conditions have exhibited a tendency to induce substantial (metabolic) alterations. The aim of the present dissertation was, therefore, to develop a method that enables the determination of mitochondrial function within intact tissue, rather than isolated cells, without method-induced metabolic alterations. Such an approach promises to provide a more unadulterated representation of mitochondrial function.

Methods: To determine the mitochondrial oxygen consumption rate (OCR) ex vivo in tissue biopsies, a series of establishment steps were performed. These steps encompassed the assessment of various biopsy punch sizes, the production of microsieves using 3D printing technology, the precise titration of inhibitors, the adjustment of experiment duration and measurement intervals, and the execution of experiments to assess both reproducibility and robustness. The measurements were systematically established and validated for liver, (white and brown) adipose tissue, heart, and pancreas using murine tissue samples. Subsequently, an investigation was conducted to analyze the impact of dietary interventions, including a twelve-week high fat-diet (HFD), high- sucrose diet (HSD), and western diet (WD) in young mice, an HFD in matured mice, a two-year aging process, and overnight fasting on the OCR of these various organs. In order to provide a comprehensive characterization of mitochondrial function, supplementary techniques such as western blot analyses and electron microscopy were employed.

Results: A novel ex vivo method for the determination of the mitochondrial OCR in murine tissue biopsies was successfully established. This methodology provided the opportunity to investigate the impact of metabolic stress induced by dietary factors, aging, and fasting on OCR. A three-months dietary intervention at a young age showed minimal effects on mitochondrial respiration but did result in a reduction of respiratory chain complexes II and IV in adipose tissue. In contrast, aged mice exposed to HFD exhibited reduced hepatic metabolic flexibility and demonstrated an elevated OCR in both white adipose tissue (eWAT) and brown adipose tissue (BAT). The reduction in hepatic metabolic flexibility was not observed in the context of prolonged aging without additional metabolic stress; instead, prolonged aging led to an increase in OCR in brown adipose tissue (BAT). Fasting induced an increase in OCR in liver and pancreatic tissue while reducing the weight of these two organs.

Conclusion: Utilizing the established ex vivo measurements, we were able to comprehensively assess the mitochondrial function in the liver, brown and white adipose tissue, pancreas, and heart. Furthermore, this method allowed a thorough analysis of the effects induced by metabolic stressors.