Aggregation, Struktur und pathologische Wirkung des Amyloid-ß Peptides: die Rolle des GxxxG-Motivs

Abstract

Der Oligomerisierung des Aß42 Peptids wird eine ursächliche Rolle bei der Alzheimer Krankheit zugeschrieben. Bevor die Peptide zu Fibrillen aggregieren, wirken besonders niedere Oligomere neurotoxisch und könnten für den Verlust der kognitiven Fähigkeiten des Patienten verantwortlich sein. Da durch eine sequenzielle Prozessierung des APP Aß mit variierender Länge entstehen, war ein erster Schwerpunkt dieser Arbeit die Untersuchung der verschiedenen Peptide. Dabei konnte gezeigt werden, je kürzer die Peptide sind, desto weniger häufig werden höhere Oligomere ausbildet. Obwohl alle Peptide vergleichbar hohe Mengen an Tetrameren gebildet hatten und diesen Formen in der Literatur als potentiell toxisch beschrieben sind, konnte nur Aß42 ein toxischer Effekt zugeschrieben werden. Für das GxxxG-Dimerisierungsmotiv innerhalb der Aß Sequenz zeigte sich, dass dieses Motiv auch für die Aggregation und das pathologische Verhalten des A42 Peptids kritisch ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals der Einfluss eines Aminosäureaustausches innerhalb des Aß GxxxG-Motivs auf Aggregation, Struktur und Toxizität beschrieben werden. Strukturelle Untersuchungen zeigten, dass die Erhöhung der Hydrophobizität an Position Gly33 den Faltungskern des Peptides stabilisiert und die Oligomerisierung des Peptides forciert. Die Abschirmung der hydrophoben Oberflächen, führt zur Krümmung der Aggregate und lässt somit keine Fibrillenbildung mehr zu. Im Gegensatz dazu wird bei der Aß42 G29A Variante die tetramere Untereinheit durch Anlagerung gegenüberliegender Gly29 durch erhöhte Hydrophobizität stabilisiert, was in einer verlängerten Fibrillenbildung resultiert. Ein doppelter Austausch von Gly29 und Gly33 führt zu einer intermediären Oligomerisierung, wobei auch hier keine reifen Fibrillen gebildet wurden. Neben der Aggregation und Struktur wurde auch erstmals detailliert die funktionelle Rolle des GxxxG-Motives mittels Toxizitätstests und im Modellsystem für Lernen und Gedächtnis (LTP Messung) untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass eine Substitution an Position Gly33 weder in vitro noch in vivo toxische Effekte hat, noch LTP inhibiert. Für das Aß42 wt und Aß42 G29A Peptid hingegen konnte gezeigt werden, dass weder Fibrillen, noch höhere Oligomere sondern ausschließlich niedere Oligomere, vor allem Tetramere, toxisch wirken. Diese Effekte konnten in reduzierter Form auch bei Aß42 G29/33A beobachtet werden, was das intermediäre Verhalten der Variante weiter unterstreicht. Dennoch konnte sowohl bei Aß42 wt als auch Aß42 G33I Peptid eine Reduktion der basalen synaptischen Transmission und eine Aufnahme des Peptids in die Zelle und den Zellkern ermittelt werden. Die Ergebnisse zeigen auf, dass das zentrale GxxxG-Motiv des Aß Peptids, und Gly33 im Besonderen, eine essentielle Rolle nicht nur im Aggregationsverhalten des Peptides spielt. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass vor allem Tetramere toxische Oligomerformen sind, jedoch der Aggregationszustand nicht grundsätzlich ausschlaggebend für die Toxizität ist. Besonders interessant ist, dass die strukturelle Veränderung des Peptides durch Austausch an Position Gly33 das pathologische Verhalten aufhebt. Diese Erkenntnisse eröffnen die Möglichkeit, mit dem Werkzeug neuer Aß42 Varianten, die genauen Mechanismen der toxischen Wirkungsweise von oligomeren Aß Formen zu erforschen. Daraus wiederum könnten weiterführend neue Therapieansätze entwickelt werden.

The oligomerization of Aß42 peptides plays a critical role in Alzheimer’s disease. Before aggregating to fibrils, low-n oligomers are known to be neurotoxic and cause cognitive deficits. Based on the model of the sequential cleavage of APP there exist a heterogenous mixture of different Aß species of variying length. In the first part of this work, analysis of the oligomerization and toxicity of those shorter peptides were performed. It could be demonstrated that the shorter the peptide the fewer higher oligomers were generated. Although all peptides formed high amounts of tetramers, which were described in literature to be potentially toxic, only Aß42 cause toxic effects. Earlier studies could already underline the importance of the GxxxG- motivs within the Aß sequence in APP processing. Furthermore these motives were postulated to play a role in aggregation and pathological behavior of Aß42 peptides. In structural analyses it could be demonstrated that increased hydrophobicity at position Gly33 stabilizes the folding nucleus of the peptide and thereby accelerate the oligomerization. The shielding of the ß-sheets from the polar milieu leads to a bending of the peptide and thus a suppression of the fibril formation. In contrast, Aß42 G29A stabilizes the tetrameric subunit resulting in an elongated fibril formation. Even though double substitutions of Gly29 and Gly33 are resulting in an intermediate oligomerization but also do not form fibrils. Despite the aggregation and structure, a detailed functional role of the GxxxG-motifs was analyzed for the first time using toxicity assays and a system for learning and memory (LTP measurements). It was observed that Gly33 substitution neither in vitro nor in vivo had any toxic effects, or inhibited LTP. For Aß42 wt and Aß42 G29A peptides it could be demonstrated that neither fibrils nor higher oligomers influenced the cell viability. Only low-n oligomers, mainly tetramers dramatically reduced the number of cells. This effect could also be recorded in a reduced form for Aß42 G29/33A, underlining the intermediate behavior. Nevertheless, both Aß42 wt and Aß42 G33I peptides reduced the basal synaptic transmission and were taken up by the cells and transported into the nucleus. In conclusion these results demonstrate that the central GxxxG-Motiv of Aß and especially Gly33 plays a critical role in aggregational and toxic behavior of the peptide. Furthermore, the data reveal that even though tetramers are most toxic oligomers, toxicity does not depend on aggregation form, but the structural change. Interestingly, the structural changes caused by amino acid exchange at position Gly33 completely abolish the pathological behavior. These findings enable, with the new Aß42 variants as a powerful tool, the detailed analysis of the toxic mechanism of Aß42 oligomers and opens new possibilities for developing new therapeutic approaches.